河南省2010年腸道病毒EV71型分離株全基因組序列分析*

李幸樂，許玉玲，黃學(xué)勇，陳豪敏，許汴利

河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病所鄭州 450016

#通訊作者，男，1958年3月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向:流行病與寄生蟲病，E-mail:xubl@hncdc.com.cn

河南省2010年腸道病毒EV71型分離株全基因組序列分析*

李幸樂，許玉玲，黃學(xué)勇，陳豪敏，許汴利#

河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病所鄭州 450016

#通訊作者，男，1958年3月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向:流行病與寄生蟲病，E-mail:xubl@hncdc.com.cn

手足口病;腸道病毒71型;測(cè)序;同源性分析

目的:了解2010年河南省流行的腸道病毒(EV)71型基因特征。方法:篩選2010年河南省分離的EV71型病毒株1株(EV71/Henan/DC/2010)，進(jìn)行全基因組序列測(cè)定和基因進(jìn)化特性分析。結(jié)果:EV71/Henan/ DC/2010與其他EV71病毒株相比，編碼區(qū)無核苷酸的缺失或插入，5’UTR區(qū)和3’UTR區(qū)長(zhǎng)度和序列有一定差異。核苷酸同源性比較顯示，EV71/Henan/DC/2010與2008年北京暴發(fā)流行株同源性最高(99.2%)，與安徽阜陽(yáng)暴發(fā)流行株和河南省暴發(fā)流行株均具有很高的同源性(98.1%和99.1%);與EV71各亞型代表株的比較結(jié)果顯示，除VP3區(qū)以外，EV71/Henan/DC/2010各區(qū)均與C4亞型代表株同源性最高;氨基酸同源性比較結(jié)果顯示，EV71/ Henan/DC/2010大多數(shù)核苷酸變異屬無義突變，相應(yīng)氨基酸并未隨之發(fā)生改變。根據(jù)VP1區(qū)基因序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化分析樹顯示，EV71/Henan/DC/2010與C4亞型同屬一個(gè)分支。結(jié)論:EV71/Henan/DC/2010與2008年北京EV71流行株親緣關(guān)系最為接近，同屬于C4亞型。與我省及我國(guó)既往流行毒株相比，未發(fā)生大的變異。

腸道病毒(Enterovirus，EV)71型屬小RNA病毒科腸道病毒屬成員。自1974年首次報(bào)道從美國(guó)加利福尼亞州暴發(fā)的表現(xiàn)有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者糞便標(biāo)本中分離到EV71病毒以來，世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼報(bào)道了該病毒的暴發(fā)和流行。EV71的感染主要引起手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)，重癥患者可表現(xiàn)為無菌性腦膜炎、腦炎等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾?。?-2］。1997年馬來西亞EV71病毒感染大暴發(fā)，隨后該病毒感染率在亞洲地區(qū)呈逐年上升趨勢(shì)。2008年3至4月我國(guó)安徽省阜陽(yáng)市發(fā)生兒童感染EV71疫情，此后我國(guó)大陸各地相繼出現(xiàn)EV71疫情，至今一直居高不下。2010年HFMD在河南省仍然呈現(xiàn)大的流行，實(shí)驗(yàn)室診斷EV71為主要病原體。該研究對(duì)2010年河南分離的1株EV71進(jìn)行了全基因序列測(cè)定，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了詳細(xì)的全序列分析和進(jìn)化途徑分析，以闡明EV71基因組結(jié)構(gòu)和致病性的關(guān)系，為EV71的基礎(chǔ)研究和防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及來源 該研究所選用的EV71毒株來自2010年河南省疾病預(yù)防控制中心全省監(jiān)測(cè)所分離到的毒株，毒株分離自死亡病例的胸水標(biāo)本。患兒為11個(gè)月齡女嬰，經(jīng)臨床確診為HFMD，合并重癥心肌炎及肺炎、肺水腫死亡。分別采集患兒糞便、胸水和腹水標(biāo)本，經(jīng)RD、Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)不產(chǎn)生病變，經(jīng)Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)自胸水得到病毒，RT-PCR方法鑒定為 EV71型，命名為 EV71/Henan/DC/ 2010。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 病毒基因組RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，TaKaRa RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)［3］，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成全基因組測(cè)序用引物。

1.4 病毒cDNA的獲取和PCR擴(kuò)增 根據(jù)天根試劑盒操作說明提取病毒基因組RNA，根據(jù)TaKaRa試劑盒說明利用隨機(jī)六聚體引物獲取病毒cDNA。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增EV71特異片段。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，50℃退火40 s，65℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán);65℃延伸10 min。

1.5 病毒基因組序列測(cè)定和分析 將以上12對(duì)引物及PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAStar 7.0編輯，同時(shí)采用DNAStar 7.0、CLUSTALX 1.81和Mega 4.0進(jìn)行序列比較分析，RNA Sturcture 4.6軟件用于5’非編碼區(qū)(5’UTR)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。EV71參比毒株均取自GenBank［3-5］，所選取 EV71參考毒株的基因型、名稱和序列號(hào)如下。A:BrCr(U22521);B:MS/ 7423/87(U22522);C1:PLday1/CH/06(EU414335)，0389-MAA-00(AY207626);C2:1245a/98/tw(AF176044)，2912-TAI-98(AF286522);C3:KOR-EV71-02(AY125967)，KOREV71-07(AY125971);C4:SHZH98(AF302996); 2008北京EV71流行株:BJO8-Z011-4(FJ606448); 2008安徽EV71流行株:Fuyang/17.08/2(EU703813); 2008河南EV71流行株:HENAN08(GU366191);腦炎株:TW984(DQ133458);輕癥株:Zhejiang08 (EU864507)。

2 結(jié)果

2.1 EV71病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 對(duì)12對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均采用雙向重疊測(cè)序，以確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。12個(gè)首尾相互重疊的PCR片段覆蓋了除Ploy(A)尾之外的整個(gè)基因組。核苷酸序列測(cè)定結(jié)果顯示，EV71/Henan/DC/2010株全基因組［未包括 Poly (A)尾］長(zhǎng)度為7 406 bp，其中A占27.21%，G占23.90%，C占23.86%，U占25.03%。腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸豐富(A+T=52.24%)。從基因組的5’端開始有743個(gè)堿基的非編碼區(qū)(5’UTR)，與BrCr株相同。5’UTR之后為6 579 bp的編碼區(qū)，編碼含2 193個(gè)氨基酸的多聚蛋白，其后為81個(gè)堿基的3’UTR。與其他 EV71毒株相比，EV71/Henan/DC/2010在編碼區(qū)沒有核苷酸的缺失和插入。

2.2 病毒基因組核苷酸序列分析

將EV71/Henan/DC/2010株序列與EV71原型株BrCr、各亞型代表株、CA16 G-10以及2008年北京流行株、安徽流行株和河南省流行株序列進(jìn)行比較，核苷酸同源性見表1。

EV71/Henan/DC/2010株全基因序列與 BrCr (基因型A)的同源性為85.4%，與MS/7423/87(基因型B)的同源性為87.1%，與基因型C的同源性為87.3%～94.2%。與北京、安徽、河南2008年流行株的同源性分別為99.2%、98.1%和99.1%，與CA16 G-10的同源性為72.7%。

在整個(gè)基因組的5’UTR區(qū)、P1編碼區(qū)(VP2、VP3和VP1區(qū))、P2編碼區(qū)、P3編碼區(qū)和3’UTR區(qū)，EV71/Henan/DC/2010株均與北京2008年流行株同源性最高，在VP4區(qū)和安徽2008年流行株同源性最高;與EV71各亞型代表株比較，除VP3區(qū)與1245a/98/tw(C2代表株)同源性最高外，其余各個(gè)區(qū)域均與SHZH98(C4代表株)同源性最高;而在整個(gè)基因組，EV71/Henan/DC/2010株均與CA16 G-10同源性最低。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見圖1。根據(jù)配對(duì)堿基數(shù)目、位置可以看出，BrCr、TW984和Zhejiang08株中TW984穩(wěn)定性最好，Zhejiang08株的穩(wěn)定性最差。與這3株相比，EV71/Henan/DC/2010該區(qū)域的二 級(jí)結(jié)構(gòu)與Zhejiang08株完全相同，穩(wěn)定性一致。

表1 EV71/Henan/DC/2010株與其他EV71毒株核苷酸同源性比較結(jié)果 %

圖1 EV71 5’UTR(第453～561位堿基)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

2.3 病毒基因組氨基酸序列分析 EV71/Henan/ DC/2010株病毒基因組編碼區(qū)全長(zhǎng)6 579個(gè)核苷酸，編碼2 193個(gè)氨基酸。EV71/Henan/DC/2010株與其他EV71毒株氨基酸同源性比較結(jié)果，見表2。EV71/Henan/DC/2010株編碼區(qū)氨基酸序列與BrCr(基因型A)的同源性為94.6%，與MS/7423/ 87(基因型B)的同源性為95.5%，與基因型C的同源性為95.5%～96.0%。與北京、安徽、河南2008年流行株的同源性分別為 99.5%、99.5%和98.9%。結(jié)果顯示大多數(shù)核苷酸變異屬無義突變，相應(yīng)氨基酸并沒有發(fā)生改變。在結(jié)構(gòu)蛋白P1區(qū)，包括VP4、VP2、VP3和VP1區(qū)，EV71/Henan/DC/2010株與CA16的同源性最低，與EV71各基因型同源性都較高，其中VP4的同源性均為100.0%;在非結(jié)構(gòu)蛋白P2區(qū)，EV71/Henan/DC/2010株與CA16的同源性較高，與MS/7423/87株(B型代表株)同源性最低;在非結(jié)構(gòu)蛋白P3區(qū)，EV71/Henan/DC/2010株也與CA16株同源性較高，與PLday1/CH/06株(C1型代表株)同源性最低。

表2 EV71/Henan/DC/2010株與其他EV71毒株氨基酸同源性比較結(jié)果 %

2.4 病毒基因遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)VP1區(qū)核苷酸序列分析構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖2。結(jié)果顯示，EV71/ Henan/DC/2010株與2008北京分離株、安徽阜陽(yáng)株和河南分離株同屬C4亞型;與核苷酸同源性比較結(jié)果一致。

圖2 EV71病毒VP1區(qū)的遺傳進(jìn)化分析樹

3 討論

該研究選取了2010年河南省HFMD流行期間的一個(gè)死亡病例分離株作為研究對(duì)象。與大多數(shù)EV71毒株不同:取該病例的標(biāo)本直接進(jìn)行PCR以及RT-PCR，顯示為PE陽(yáng)性，EV71陰性。病毒在RD和Hep-2細(xì)胞不產(chǎn)生病變，在Vero細(xì)胞上有連續(xù)穩(wěn)定病變出現(xiàn)，經(jīng)鑒定為EV71毒株。對(duì)該毒株進(jìn)行全基因組序列的測(cè)定和分析，結(jié)果表明，EV71/ Henan/DC/2010株與其他EV71毒株有著相同的基因結(jié)構(gòu)。

5’UTR區(qū)第453～561位堿基(以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株BrCr為準(zhǔn))與 Polio病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)第Ⅴ區(qū)結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)。該區(qū)域同Polio病毒毒力密切相關(guān)。EV71病毒與Polio病毒同屬微小RNA病毒科腸道病毒屬，病毒結(jié)構(gòu)高度類似［4-6］，為探索EV71/Henan/DC/2010毒力，利用RNA Structure軟件對(duì)腸道病毒EV71型的相同位點(diǎn)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，盡管EV71/Henan/DC/2010毒株致患兒死亡，但其與來自輕癥病例的 Zhejiang08株在該區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)完全一致，穩(wěn)定性相同。可以排除該位點(diǎn)變異導(dǎo)致病毒毒力增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致的患兒死亡。

對(duì)EV71病毒VP1區(qū)核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示EV71/Henan/DC/2010為C4亞型，與2008北京、河南、安徽三地流行株都具有相當(dāng)高的同源性，提示EV71病毒株目前相對(duì)穩(wěn)定，沒有發(fā)生大的變異。EV71/Henan/DC/2010尤其與 2008北京EV71流行株的同源性最高，分析原因可能如下:河南為人口大省，每年有大量人口輸出至北京，且鄭州和北京同為重要的交通樞紐，人口來往密集頻繁，病毒在兩地之間的傳播快。河南EV71致死株與2008年北京流行株的高度同源性提示人口流動(dòng)在EV71病毒傳播中的重要性。

對(duì)EV71/Henan/DC/2010株的上述研究表明，EV71/Henan/DC/2010株從5’UTR區(qū)、VP1區(qū)和全基因序列上與我國(guó)目前分離到的EV71毒株無顯著不同，毒力也沒有顯著變化。針對(duì) EV71/Henan/ DC/2010株致患兒死亡，分析原因可能如下:病毒毒力增加，宿主自身的因素。宿主生活習(xí)慣、免疫水平差異等都會(huì)影響病毒的作用。該研究結(jié)果從分子水平上暫時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致病毒毒力增強(qiáng)的因素，因此更傾向認(rèn)為此次致死來自于宿主自身的因素。同時(shí)也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，病毒毒力的影響因素在病毒基因組中并非由單一位點(diǎn)決定，而是由多個(gè)位點(diǎn)共同決定的，由于來源于死亡病例的EV71全基因序列較少，短時(shí)間內(nèi)尚不能得到致死EV71毒株分子水平的共性。這還有待于長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)和研究，獲取大量毒株進(jìn)行比對(duì)分析。

［1］Lee TC，Guo HR，Su HJ，et al.Diseases caused by enterovirus 71 infection［J］.Pediatr Infect Dis J，2009，28(10): 904

［2］楊凌，胡景偉，周忠蜀.腸道病毒71型感染與手足口病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2008，23 (22):1782

［3］黃學(xué)勇，陳豪敏，馬宏，等.2009年河南省腸道病毒71型基因組特征分析［J］.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，11 (7):675

［4］張欣，鄧小玲，管大偉，等.2008年廣東省腸道病毒71型分離株全基因組核苷酸序列分析［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2009，29(4):316

［5］Hung HC，Chen TC，F(xiàn)ang MY，et al.Inhibition of enterovirus 71 replication and the viral 3D polymerase by aurintricarboxylic acid［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65 (4):676

［6］Chang GH，Lin I，Luo YJ，et al.Sequence analysis of six enterovirus 71 strains with different virulences in hunmans［J］.Virus Res，2010，151(1):66

Complete sequence analysis of Enterovirus 71 strain from a fatal case of hand-foot-mouth disease during an epidemic of Henan province in 2010

LI Xingle，XU Yuling，HUANG Xueyong，CHEN Haomin，XU BianliInfectious Disease Institute，Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention，Zhengzhou 450016

hand-foot-mouth disease;Enterovirus 71;sequencing;homology analysis

Aim:To investigate the genetic characteristics of Enterovirus 71(EV71)circulating strains of Henan province in 2010.Methods:The EV71 strain isolated from a fatal case of hand-foot-mouth disease during an epidemic of Henan in 2010 was chosen.Its complete genome was sequenced and analyzed comparatively.Results:The results showed that EV71/Henan/DC/2010 had no insertion or deletion detected in the coding region but several insertions and deletions in 5’and 3’UTR.Phylogenetic analysis of EV71/Henan/DC/2010 and reference strains showed it had the highest nuclyeotide homology with 2008 Beijing epidemicstrain FJ606448(99.2%)，and with Anhui epidemicstrain EU703813 and Henan epidemicstrain GU366191(98.1%and 99.1%).The majority nucleotide variations were nonsensemutation，and the corresponding amino acid did not change along with it.In all but VP3 regions，EV71/Henan/DC/2010 had the highest nucleotide homology with C4 subtype.It clustered with reference strains of C4 subtype in the phylogenetic tree.Conclusion: EV71/Henan/DC/2010 strain has the nearest genetic relationship with 2008 Beijing epidemicstrain FJ606448，both belong to the C4 subtype.EV71/Henan/DC/2010 strain has not remarkable variation.

R183.4

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)基金資助重大項(xiàng)目 201001015

(2010-12-23收稿 責(zé)任編輯姜春霞)