張 祥，闞全程#，余祖江，王 鵬

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)護(hù)理學(xué)院鄭州 450001

#通訊作者，男，1963年9月生，博士，教授，主任藥師，研究方向:免疫藥理，E-mail:sennheiser163@163.com

PreS-Tat真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)*

張 祥1)，闞全程1)#，余祖江2)，王 鵬3)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)護(hù)理學(xué)院鄭州 450001

#通訊作者，男，1963年9月生，博士，教授，主任藥師，研究方向:免疫藥理，E-mail:sennheiser163@163.com

PreS;Tat;乙型肝炎病毒;蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)

目的:構(gòu)建pEGFP-PreS-Tat嵌合載體并在真核細(xì)胞中表達(dá)。方法:提取人乙型肝炎病毒并用PCR法擴(kuò)增出PreS片段，定向克隆入pEGFP-C3載體，在PreS下游連接合成的Tat序列，構(gòu)建成功的pEGFP-PreS-Tat質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，Western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果:酶切和測序結(jié)果表明成功地構(gòu)建了pEGFP-PreSTat嵌合載體，Western Blot結(jié)果表明該載體能在Hela細(xì)胞中表達(dá)pEGFP-PreS-Tat融合蛋白。結(jié)論:成功構(gòu)建pEGFP-PreS-Tat載體并表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白，為研究該融合蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起病毒性肝炎最常見的病原體，全球目前大約有3.5億慢性HBV攜帶者［1］，中國HBV表面抗原攜帶率為9.75%。隨著病情的發(fā)展，每年有超過100萬人死于慢性活動性肝炎、肝硬化及原發(fā)性肝癌等肝臟疾病或相關(guān)并發(fā)癥［2］。然而目前用于肝病治療的藥物如干擾素類、胸腺肽類及核苷酸類似物并不能完全清除HBV。近來肝臟疾病特異性藥物與基因治療已顯示出一定的前景，其中目的蛋白的靶向性一直是肝臟疾病藥物與基因治療研究領(lǐng)域的重要研究方向［1］。研制出一種靶向、高效、安全的蛋白是基因治療的關(guān)鍵。因此作者根據(jù)HBV病毒PreS基因和HIV病毒Tat基因的特點構(gòu)建出具有特異性轉(zhuǎn)運(yùn)作用的靶向蛋白，為進(jìn)一步的基因治療打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和菌株 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、KpnⅠ、BamhⅠ、T4 DNA連接酶和蛋白質(zhì)Marker購自寶生物工程(大連)有限公司，PCR純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京全式金公司。Axygen體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒寡核苷酸退火緩沖液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。鼠抗PreS1和兔抗鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。質(zhì)粒和細(xì)胞系pEGFP-C3載體，宿主大腸桿菌DH5α，Hela細(xì)胞由鄭州大學(xué)臨床藥理研究所提供。

1.2 Tat雙鏈和HBV PreS引物的合成 Tat雙鏈和PreS引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。按照Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)(protein transduction domain，PTD)48～60位 11個氨基酸(YGRKK RRQRRR)合成編碼PTD的片段:上游5’-CTACGG TAGGAAAAAACGCCGCCAGCGCCGCCGCG-3’，下游5’-GATCCGCGGCGGCGCTGGCGGCGTTTTTTCCT ACCGTAGGTAC-3’。使用前用DNA寡核苷酸退火緩沖液做退火處理，退火后得到雙鏈片段。HBV PreS引物:上游 5’-CGCAAGCTTATGGGAGGTTG GTCTTCCAAACCTCGAC-3’，下游5’-CGCGGTACC GTTCGGTGCAGGGTCCCCAGTCCTCG-3’。上下游引物中分別加入HindⅢ和KpnⅠ酶切位點。

1.3 HBV PreS片段的擴(kuò)增 取已經(jīng)被確認(rèn)的HBV感染者的陽性血清，按照病毒提取試劑盒說明提取HBV DNA。依次加入PreS上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積50 μL。反應(yīng)條件為94℃3 min;然后進(jìn)入主循環(huán)94℃30 s，55℃ 30 s，72℃60 s，共35個循環(huán);72℃ 10 min，然后收集產(chǎn)物，4℃保存產(chǎn)物。取5 μL，用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，最后用PCR純化試劑盒純化和回收所需要的目的基因片段。

1.4 pEGFP-PreS載體的構(gòu)建 HindⅢ、KpnⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pEGFP-C3載體，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，涂板，37℃培養(yǎng)，挑單菌落常規(guī)方法培養(yǎng)，用PreS上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，陽性菌落提取質(zhì)粒為pEGFP-PreS載體。

1.5 pEGFP-PreS-Tat載體的構(gòu)建 Tat合成產(chǎn)物經(jīng)PCR儀退火成雙鏈，HindⅢ、KpnⅠ雙酶切pEGFP-PreS-Tat載體，T4連接酶與Tat雙鏈連接，連接產(chǎn)物常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落培養(yǎng)。以PreS上游引物與Tat反義鏈為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取陽性反應(yīng)菌落提取質(zhì)粒，HindⅢ和BamhⅠ雙酶切鑒定。所得質(zhì)粒送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序鑒定。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 按Invitrogen的脂質(zhì)體試劑盒轉(zhuǎn)染操作手冊進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。取4 μg PEGFPPreS-Tat質(zhì)粒和10 μL脂質(zhì)體，分別加入125 μL無血清培養(yǎng)液，平衡5 min后合并溶液，混勻，室溫孵育30 min。轉(zhuǎn)染前30 min吸去細(xì)胞培養(yǎng)液加入新鮮培養(yǎng)液750 μL，將質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物逐漸加入，放入體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液。

1.7 pEGFP-PreS-Tat蛋白的提取和Western blot鑒定 4℃預(yù)冷的PBS洗去培養(yǎng)液，裂解液裂解，提取總蛋白。BCA法測定細(xì)胞提取物中蛋白含量，取總蛋白40 μL，加5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳，80 V電壓轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將PVDF膜用TBS沖洗，放入30 g/L脫脂奶粉中封閉1 h，TBST洗膜2×10 min，加入鼠抗PreS1(1-500稀釋)，4℃過夜。棄一抗，TBST洗膜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1-8 000稀釋)，平穩(wěn)搖動，室溫2 h，棄二抗，TBST沖洗，化學(xué)發(fā)光法顯影，暗室壓片。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-PreS-Tat載體酶切鑒定 結(jié)果見圖1。經(jīng)雙向測序完全正確，載體構(gòu)建成功。

圖1 pEGFP-PreS-Tat載體酶切鑒定

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和pEGFP-PreS-Tat蛋白的Western blot鑒定 見圖2。梭形細(xì)胞為 Hela細(xì)胞。Western blot結(jié)果見圖3。

3 討論

該研究中HBV的PreS基因包括PreS1區(qū)和PreS2區(qū)。Lin［3］等通過實驗證明，HBV大分子蛋白的PreS2區(qū)參與病毒與肝細(xì)胞膜的結(jié)合，PreS1蛋白60～108位氨基酸與HepG2的結(jié)合密切相關(guān)［4］。Miyata等［5］研究證明經(jīng)過PreS1修飾的大分子物質(zhì)，可以作為一種肝臟特異給藥的無嚴(yán)重不良反應(yīng)的載體，而同樣的載體在人表皮鱗狀細(xì)胞癌中卻并無相應(yīng)的腫瘤抑制作用。由此可見，PreS1的特殊的導(dǎo)向作用是其作為肝病治療藥物的一個非常好的選擇。近些年來，伴隨著對PreS2研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在HBV附著，侵入肝細(xì)胞中起著重要作用［6］。其肽段內(nèi)還包含有T細(xì)胞受體，特異性T、B淋巴細(xì)胞結(jié)合點和Ⅰ、Ⅱ類主要組織相容性抗原(MHC)限制性［7］，還能引起中和抗體和保護(hù)性免疫的發(fā)生，參與調(diào)節(jié)HBV引起的細(xì)胞及體液免疫［8］。

PTD是近年來發(fā)現(xiàn)的一類在蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，能高效穿過生物膜的結(jié)構(gòu)域，當(dāng)其與蛋白質(zhì)、多肽或等分子共價連接時，可將這些分子高效地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。此外還有研究［9］證明，Tat還可以攜帶核苷酸、脂質(zhì)體、甚至金屬微粒進(jìn)入幾乎所有的組織和細(xì)胞，具有速度快，不依賴溫度、能量、細(xì)胞膜抗體等特性，由于Tat蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞不具有細(xì)胞特異性，因此可能為患者帶來不可預(yù)知的風(fēng)險。如何提高Tat蛋白在目標(biāo)細(xì)胞中的濃度，是目前Tat蛋白研究的熱點。

該研究構(gòu)建了pEGFP-PreS-Tat載體并成功表達(dá)了目的蛋白。該蛋白不僅表達(dá)有具有穿透功能的Tat蛋白，還具有肝臟細(xì)胞特異性的PreS蛋白。這樣的結(jié)合一方面滿足了治療性蛋白或者藥物向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸功能，另一方面由于PreS蛋白能與肝臟細(xì)胞特異結(jié)合，對于肝臟細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的提高更有幫助。避免了由于與Tat蛋白的非特異穿透性可能帶來潛在的危險。所以，該融合蛋白可以作為藥物特異轉(zhuǎn)運(yùn)入肝臟細(xì)胞的良好載體。當(dāng)然，對于PreS2蛋白來講，由于其聚合人乳清蛋白結(jié)合位點可能與人體內(nèi)聚合人血清蛋白結(jié)合而使PreS蛋白的肝臟特異性受到影響［8］，所以通過基因突變技術(shù)避免其聚合人乳清蛋白結(jié)合位點的表達(dá)可能會使該融合蛋白的肝臟特異性更好地體現(xiàn)出來。融合蛋白發(fā)揮其生物效應(yīng)的重要基礎(chǔ)是細(xì)胞靶向性，該研究肝臟細(xì)胞靶向性蛋白的成功表達(dá)為下一步HBV抑制蛋白和肝癌細(xì)胞殺傷蛋白的研究打下了基礎(chǔ)。

［1］Loomba R，Liang TJ.Novel approaches to new therapies for hepatitis B virus infection［J］.Antivir Ther，2006，11(1): 1

［2］Lavanchy D.Hepatitis B virus epidemiology，disease burden，treatment，and current and emerging prevention and control measures［J］.J Viral Hepat，2004，11(2):97

［3］Lin Y，Liu YX，Cislo T，et al.Expression and characterization of the preS1 peptide of hepatitis B surface antigen in Escherichia coli［J］.J Med Virol，1991，33(3):181

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Construction and expression of eukaryotic vector encoding PreS-Tat

ZHANG Xiang1)，KAN Quancheng1)，YU Zujiang2)，WANG Peng3)1)Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500522)Department of Infectious Diseases，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

3)College of Nursing，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

PreS;Tat;hepatitis B virus;protein transduction domain

Aim:To construct the chimeric vector PreS-Tat and express it in the eukaryotic cells.Methods:After amplifying the HBV PreS gene，the products were cloned into the pEGFP-C3 vector.The synthetic Tat sequences were inserted into the downstream of the PreS.The resultant recombinant vectors were transfected into eukaryotic cell Hela by lipofectamine.Western blot was used to certify the purpose protein.Results:The recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease and sequencing.The pEGFP-PreS-Tat fusion protein was successfully expressed in the Hela cells.Conclusion:pEGFP-PreS-Tat has been constructed and the fusion protein is expressed successfully，which lays the foundation for studying the functions of the protein.

Q784

*國家自然科學(xué)基金資助項目 30472031

(2010-10-28收稿 責(zé)任編輯李沛寰)