王 捷，謝樹蓮，王中杰，徐 瑤，李仁輝＊＊

(1:山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006)

(2:中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072)

汾河(太原市景區(qū)段)微囊藻的分子多樣性及產(chǎn)毒能力*

王 捷1，2，謝樹蓮1，王中杰2，徐 瑤2，李仁輝2＊＊

(1:山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006)

(2:中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072)

對太原市汾河景區(qū)采集到的微囊藻進(jìn)行分離純化，得到7株微囊藻藻株，運(yùn)用ITS、PC-IGS和gyrB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)樹來研究其分子多樣性.結(jié)果表明，太原市汾河景區(qū)微囊藻具有一定的分子多樣性.采用mcyA基因和ELISA檢測兩種方法，即全細(xì)胞PCR測定微囊藻毒素合成酶基因A(mcyA)，對這些藻株的微囊藻毒素進(jìn)行測定，檢測的7株微囊藻中有6株含有mcyA基因，ELISA檢測微囊藻細(xì)胞干粉產(chǎn)毒量在0.003-0.043mg/g之間，屬于產(chǎn)低毒藻種.本文是首次報道太原市汾河景區(qū)微囊藻產(chǎn)毒素，也為汾河水環(huán)境保護(hù)提出了更高的要求.

汾河景區(qū);微囊藻;分子多樣性;毒素

水體的富營養(yǎng)化和藍(lán)藻水華已成為全球關(guān)注的重要環(huán)境問題［1］.研究表明藍(lán)藻水華涵蓋了許多種(屬)，如微囊藻屬(Microcystis)、魚腥藻屬(Anabaena)、浮絲藻屬(Planktothrix)、束絲藻屬(Aphanizomenon)、擬柱胞藻屬(Cylindrospermopsis)等，其中以微囊藻水華最為常見［2］.

微囊藻水華的形成給淡水環(huán)境帶來了極大的影響.一些種類的微囊藻能產(chǎn)生次生代謝物微囊藻毒素(microcystin，MC)，該毒素是富營養(yǎng)化水體中最主要的藍(lán)藻毒素類型，直接威脅水中魚類及其它生物的生存，引發(fā)中毒甚至死亡.飲用水源中的微囊藻毒素會對人類的肝臟造成損傷并會引起肝癌，影響人類的健康和生存［3］.我國是微囊藻水華較為嚴(yán)重的國家，尤其是南方地區(qū)長江流域的大中型淺水湖泊是主要的微囊藻水華發(fā)生地，因此對微囊藻的多樣性和分類及微囊藻毒素等研究大多集中在南方地區(qū)水體.近年來，虞功亮等［4-5］對昆明滇池微囊藻種類的多樣性以及我國的微囊藻新類別進(jìn)行了報道，吳忠興［6］分析了中國中北部和南部20株微囊藻的多樣性，劉海林等［7］對江蘇太湖和潮州湯溪水庫微囊藻的分子多樣性進(jìn)行了研究.但是，目前關(guān)于我國北方地區(qū)的藍(lán)藻水華研究非常少，有關(guān)黃河流域水體中水華藍(lán)藻的報道更少，這樣的研究現(xiàn)狀和格局對于我國水華藍(lán)藻多樣性的認(rèn)識具有一定的局限性.

太原市汾河景區(qū)，即汾河太原城區(qū)段治理美化工程，全長6km.它是集休閑、度假、觀光旅游為一體的大型公園，也是太原市目前規(guī)模最大的公共綠地游樂場所［8］.近年來，由于大量工業(yè)廢水和生活污水的排入，致使汾河水污染日趨嚴(yán)重，微囊藻的數(shù)量也呈上升趨勢.本文從該景區(qū)汾河水體中分離得到了微囊藻，并在實(shí)驗(yàn)室純化培養(yǎng)，通過分子生物學(xué)的方法來研究微囊藻的分子多樣性，并對其微囊藻毒素進(jìn)行了分子生物學(xué)和化學(xué)分析.

1 材料與方法

1.1 采樣位點(diǎn)與藻株分離

樣品采于2009年8月，采用25號浮游生物網(wǎng)在位于太原市景區(qū)段的汾河水體中采集多次，置于5ml離心管中.采用經(jīng)典的毛細(xì)管法，即用巴斯德吸管制作的毛細(xì)管(Pasteur Micropipette)在解剖鏡下挑取單個群體，使用無菌純水清洗6-8次，最后放入含有2ml MA培養(yǎng)基［9］的24孔培養(yǎng)平板中培養(yǎng)，4-5周便可得到單克隆藻種，純化后的藻種編號分別為:TY001、TY002、TY003、TY004、TY005、TY006、TY007.

1.2 形態(tài)觀察

顯微觀察和拍照的設(shè)備為Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡，外接500萬像素的數(shù)碼相機(jī)(QIMAGING Micropublish 5.0 RTV)，與臺式計算機(jī)相連.用附帶的圖像分析軟件(Image-proexpress 5.1)進(jìn)行數(shù)碼拍照和細(xì)胞直徑測量，圖像測量前，使用Olympus的10μm臺測微尺校正檢驗(yàn)，測量誤差小于0.001μm.觀察時取一滴水，置于載玻片上，蓋上蓋玻片，直接用于鏡檢和顯微拍照.

1.3 PC-IGS、gyrB和ITS序列的PCR擴(kuò)增

采用全細(xì)胞PCR對PC-IGS、gyrB和ITS(16S和23S rRNA基因的間隔區(qū))序列進(jìn)行擴(kuò)增，PC-IGS基因的擴(kuò)增引物包括正向引物PCβF(5'-GGCTGCTTGTTTACGCGACA-3')和反向引物PCαR(5'-CCAGTACCACCAG-CAACTAA-3')［10］.gyrB基因的擴(kuò)增引物為正向引物gyrBF(5'-CGATGAGGCCGTAGCGGGTTACTG-3')和反向引物 gyrBR(5'-CTCTTTCGCTACAATCAGCCA-3')［11］.ITS基因的擴(kuò)增引物為正向引物(5'-AAGGGAGACCTA-ATTCVGGT-3')和反向引物(5'-TTGCGGTCYTCTTTTTTGGC-3')［12］，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成.用 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為 20μl，包含 200μM dNTPs，1.5mM MgCl2，10×buffer-PCR 緩沖液2μl，10mg/ml BSA 1μl，引物各 10pmol，1U TaqDNA聚合酶，微囊藻懸浮液(約3 ×105cells/ml)1μl，其余用雙蒸水補(bǔ)足.20μl反應(yīng)體系于 MJ Mini BioRad PCR 儀(BioRad，USA)上擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，共35次循環(huán)，72℃延伸10min.擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR純化試劑盒(Qiagen，Germany)進(jìn)行純化.

1.4 ITS、gyrB、PC-IGS 序列測定及分析

PCR測序由北京華大基因科技有限公司進(jìn)行正、反向測序，將測序得到的序列整理拼接后，用Clustal X1.83軟件對測得的基因序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中的微囊藻以及集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)的基因序列進(jìn)行多序列對齊排列.運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA4.0中的Kimura2-parameter模型計算各序列間的距離和序列相似性等，采用鄰接法(neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建NJ樹，空位或缺失位點(diǎn)均當(dāng)作配對刪除(pairwise deletion)處理.構(gòu)樹方法用自舉檢驗(yàn)(bootstrap)估計系統(tǒng)樹分支節(jié)點(diǎn)的置信度，自展數(shù)據(jù)集為1000，以集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)為外類群.

1.5 微囊藻細(xì)胞毒素測定

各取1μl微囊藻細(xì)胞于PCR管中，用mcyA(上游引物:5'-AAAATTAAAAGCCGTATC AAA-3'，下游引物:5'-AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT-3')［13］，引物全細(xì)胞PCR檢測微囊藻毒素合成酶基因A，實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性對照(M.aeruginosa 7806)和陰性對照(加無菌純水)，PCR反應(yīng)體系和條件同1.2所述.

微囊藻總毒素的測定用微囊藻毒素ELISA［14］檢測試劑盒(中國科學(xué)院水生生物研究所)進(jìn)行檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 微囊藻形態(tài)特征

群體團(tuán)塊較大，自由漂浮.細(xì)胞球形，直徑4.3-5.9μm，有氣囊(gas vesicle).群體發(fā)育早期為球形或橢圓形，中實(shí)，為青綠色或黑綠色，隨著生長群體不斷增大，最終形成不規(guī)則形狀，膠被破裂或穿孔，群體成為樹枝狀或似窗格的網(wǎng)狀體.膠被不密貼細(xì)胞，距離2μm以上.膠被無色或微黃綠色，無折光，無分層，不明顯.膠被內(nèi)細(xì)胞排列較緊密.參照胡鴻鈞和魏印心《中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài)》［15］、虞功亮等［4］所描述銅綠微囊藻形態(tài)特征，可以確定7株微囊藻均為銅綠微囊藻.

2.2 藍(lán)藻ITS基因的序列及多樣性分析

用于ITS基因序列研究的藍(lán)藻共計30株，其中包含29株微囊藻，另外還有1株外類群集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803).7株銅綠微囊藻經(jīng)Clustal X1.83軟件排序和手工調(diào)整后，得到序列矩陣總長度為320bp.用MEGA 4.0分析發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)數(shù)(V)為28，簡約信息位點(diǎn)數(shù)(Pi)為14，變異位點(diǎn)和簡約位點(diǎn)分別占總位點(diǎn)的8.75%和4.38%.不同樣品的堿基含量差異不大，堿基A、T、C和G的平均含量分別為33.8%、18.5%、21.1%和26.6%.G+C 的含量為 47.7%，A+T 的含量為52.3%，G+C 的含量稍低于 A+T 的含量.基于ITS基因構(gòu)建的NJ樹顯示，TY001和兩株日本藻種M.aeruginosa B-35、M.aeruginosa NIES298為一個聚類，說明TY001和這兩株日本藻種親緣關(guān)系較近.TY003、TY004、TY005、TY006、TY007為一個聚類，TY002單獨(dú)為一個聚類，未與來自中國北部和中部的四株銅綠微囊藻(M.aeruginosa CC1，M.aeruginosa XW01，M.aeruginosa CL1，M.aeruginosa CL3)聚為一類(圖1).

2.3 藍(lán)藻PC-IGS基因的序列及多樣性分析

用于PC-IGS基因序列研究的藍(lán)藻共計44株，其中包含43株微囊藻.7株銅綠微囊藻經(jīng)Clustal X1.83軟件排序和手工調(diào)整后，得到序列矩陣總長度為626bp.用MEGA4.0分析發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)數(shù)為72，簡約信息位點(diǎn)數(shù)為47，變異位點(diǎn)和簡約位點(diǎn)分別占總位點(diǎn)的11.5%和7.5%.不同樣品的含量差異不大，堿基A、T、C和G的平均含量分別為24.8%、24.2%、27.6%和23.4%.G+C的含量為51%，A+T的含量為49%，G+C的含量稍高于A+T的含量.基于PC-IGS基因構(gòu)建的NJ樹顯示(圖2)，用于本實(shí)驗(yàn)研究的7株銅綠微囊藻，有6株和GenBank數(shù)據(jù)庫中的銅綠微囊藻和西班牙的三株水華微囊藻(M.flos-aquae UAM-FMF-1、M.flos-aquae UAM246 和 M.flos-aquae UAM-CMF-3)為一個聚類，它們是 TY001，TY003，TY004，TY005，TY006，TY007.這個聚類中的銅綠微囊藻有6株來自于中國的云南滇池FACHB940、中國武漢東湖、上海淀山湖、黑龍江五大連池藥泉，其它中國藻株均來自于中部和南部地區(qū)，但是沒有和這6株藻聚為一類.TY002和M.panniformis SPC702為一個聚類，分支支持率為62%，這表示它和巴西的這株微囊藻親緣關(guān)系較近.

2.4 基于gyrB基因的序列及多樣性分析

用于gyrB基因序列研究的藍(lán)藻共計26株，其中，包含25株微囊藻，另外還有1株是外類群，即集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803).調(diào)整后的序列長度為960bp，用MEGA4.0分析發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)數(shù)為22，簡約信息位點(diǎn)數(shù)為10，變異位點(diǎn)和簡約位點(diǎn)分別占總位點(diǎn)的2.29%和1.04%.不同樣品的含量差異不大，堿基A、T、C和G的平均含量分別為29.3%、22.7%、23.4%和24.6%.G+C的含量為48%，A+T的含量為52%，G+C的含量稍低于A+T的含量.基于gyrB基因構(gòu)建的NJ樹顯示(圖3)，本實(shí)驗(yàn)所用的7株銅綠微囊藻，TY002，TY003，TY004，TY005，TY006，TY007 和日本的 M.ichthyoblabe TAC125 聚為一類，說明這 6 株銅綠微囊藻和日本的這株魚害微囊藻親緣關(guān)系較近.TY001和三株日本藻種(克隆)M.aeruginosa clone:gy10380.icb、M.aeruginosa NIES-91和M.aeruginosa NIES-101聚在同一分支上，分支支持率為64%.

2.5 毒素檢測

微囊藻毒素采用mcyA基因和ELISA檢測兩種方法進(jìn)行測定，mcyA基因PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除TY002外，其他6株微囊藻均擴(kuò)增出290bp的目標(biāo)條帶(圖4).

ELISA檢測實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的銅綠微囊藻毒素濃度，結(jié)果顯示，TY001，TY003，TY004，TY005和TY007產(chǎn)低濃度的毒素，毒素濃度分別為 0.043、0.003、0.004、0.018 和 0.008mg/g，TY006 雖含有產(chǎn)毒基因 mcyA，但是未檢測出毒素.利用測序得到的TY001，TY003，TY004，TY005，TY006和TY007mcyA基因核苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列，并和GenBank下載的有毒微囊藻M.aeruginosa 7806(GenBank登陸號AM778952)氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，TY006相當(dāng)于M.aeruginosa 7806的兩個氨基酸Leu-1608和Gln-1609分別變化為Tyr和Lys，即L、Q變?yōu)閅和K.

3 討論

3.1 微囊藻分子多樣性討論

到目前為止，在全球范圍內(nèi)已經(jīng)報道了50多種微囊藻，但是微囊藻的分類還是比較混亂.造成這些混亂的原因主要有:1)室內(nèi)培養(yǎng)和野外群體微囊藻種區(qū)別較大，同一微囊藻種有很高的生態(tài)表型多樣性，不同的微囊藻有時會出現(xiàn)相同的生態(tài)表型和過渡類型.2)應(yīng)用生理生化、分子生物學(xué)等方法顯示，微囊藻屬種類的基因型相似性較高［4］.傳統(tǒng)的分類學(xué)方法即通過顯微鏡觀察細(xì)胞的形狀、大小、細(xì)胞排列和膠鞘等特征來對微囊藻進(jìn)行分類，但是細(xì)胞形態(tài)會隨著生理生態(tài)等因素的影響而發(fā)生變化，出現(xiàn)復(fù)合型或過渡類型，如果僅依靠形態(tài)特征分類，會出現(xiàn)一些偏差.因此，通過形態(tài)、生理生化、分子生物學(xué)等綜合方法對不同生境的微囊藻屬種類進(jìn)行系統(tǒng)研究，揭示微囊藻屬的系統(tǒng)分類和多樣性變得非常重要［4，11，13］.目前為止，我國對于微囊藻分子多樣性的研究還很少，尤其是中國北部地區(qū).本研究從我國北方的黃河流域汾河中分離出了7株銅綠微囊藻，這也是首次得到黃河流域微囊藻藻種并對其多樣性進(jìn)行研究.一些研究者曾使用16S rRNA基因進(jìn)行分類和分子多樣性的研究，但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，此基因比較保守而不宜作為種及種以下分類水平的分類［16］.為了探明這些形態(tài)種的分子多樣性，本文選用突變頻率較高、含有豐富遺傳信息的三個基因(ITS、PC-IGS、gyrB)作為研究的目標(biāo)基因.近年來，國內(nèi)外許多研究利用ITS序列的差異來探討微囊藻種群之間的基因型以及種群之間的動態(tài)變化和演替［17-18］.陳月琴等［19］報道不同微囊藻種間ITS序列相似性為94.8%，Otsuka等［20］報道的ITS序列相似性為93.3%-100%，銅綠微囊藻種內(nèi)序列相似性為95.9%.Wu等［16］報道的微囊藻種間PC-IGS序列相似性為94.0%-99.8%.劉海林等［7］報道微囊藻 gyrB基因(974bp)種間序列相似性≥96.7%，銅綠微囊藻種內(nèi)序列相似性為98.5%.本研究中，7株銅綠微囊藻ITS基因(320bp)序列相似性為97%-100%，PC-IGS基因(626bp)序列相似性為94%-100%，gyrB基因(960bp)種內(nèi)序列相似性為97%-100%.比較這三個基因，我們可以判定PC-IGS序列的變異度要大于ITS和gyrB.基于ITS、PC-IGS基因構(gòu)建的NJ樹顯示，山西汾河銅綠微囊藻具有一定的分子多樣性，并且汾河的銅綠微囊藻與我國北部其它地區(qū)和中南部地區(qū)的銅綠微囊藻基因型存在差異.吳忠興［6］通過對我國部分地區(qū)的微囊藻進(jìn)行研究，表明中國中北部和南部地區(qū)的微囊藻有不同的基因型，這和本文結(jié)論一致.綜合以上結(jié)果表明，中國不同地區(qū)分布的微囊藻具有較高的基因多樣性.使用這三個基因構(gòu)建的NJ樹顯示的結(jié)果不相同，說明同一地域表型相同的微囊藻，基因型可能不同，但基因型的聚類和表型沒有直接關(guān)系.

3.2 微囊藻產(chǎn)毒素分析

淡水水華中發(fā)現(xiàn)的最常見藍(lán)藻毒素是微囊藻毒素，它是一類具有強(qiáng)烈促癌作用的肝毒素，主要來自于微囊藻、浮絲藻和魚腥藻等浮游性藍(lán)藻［21-22］.本研究在汾河中首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒微囊藻，分離純化得到的7株銅綠微囊藻藻株中有5株為產(chǎn)毒微囊藻，但是其產(chǎn)毒素量較低，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一般微囊藻干粉產(chǎn)毒量0.30-2.00mg/g［23］.有研究表明，環(huán)境因子對微囊藻毒素產(chǎn)生有很大的影響，這些環(huán)境因子主要包括光照、溫度、pH值、氮元素、磷元素、溶解氧等，Watanabe等［24］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光強(qiáng)增加時，M.aeruginosa M-228株的毒性逐漸增加，達(dá)到一定的強(qiáng)度后，毒性保持穩(wěn)定.Wicks等［25］研究南非Hartbeespoort水庫中的微囊藻毒素與環(huán)境因子的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，毒素濃度與太陽輻射呈正相關(guān).何振榮等［26］在研究M.aeruginosa M 8641時，讓它在溫度分別為31℃、25℃和20℃條件下生長，發(fā)現(xiàn)25℃時毒性最低，細(xì)胞增長最快，低溫有利于毒素的產(chǎn)生.連民等［27］研究不同濃度的氮、磷、鋅、鐵對HGZ培養(yǎng)基中的M.aeruginosa NIES-90產(chǎn)毒藻株的生長和產(chǎn)毒的影響時發(fā)現(xiàn)，藻毒素含量與氮、磷、鋅、鐵濃度呈正相關(guān).本研究發(fā)現(xiàn)，TY006藻株含有mcyA基因，但是未檢測出毒素.為了驗(yàn)證TY006藻株mcyA基因測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別由北京華大基因科技有限公司和上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序三次，得到的結(jié)果是相同的.基因比對結(jié)果顯示，以已經(jīng)報道的有毒微囊藻M.aeruginosa 7806的mcyA基因?yàn)閰⒄?，藻種TY006具有連續(xù)兩個氨基酸的置換變化.Bozarth等［28］發(fā)現(xiàn)在加利福尼亞州Copco水庫中的微囊藻mcyA氨基酸Lys-1610和Ser-1611中間插入了兩個氨基酸Thr和Phe，本研究中銅綠微囊藻TY006中mcyA氨基酸并沒有像Bozarth發(fā)現(xiàn)的插入氨基酸，而是出現(xiàn)連續(xù)兩個氨基酸的置換變化，這是本研究中首次發(fā)現(xiàn)的.當(dāng)然，是否由于這種變化造成銅綠微囊藻TY006的微囊藻毒素未被檢出還有待于進(jìn)一步研究.Mikalsen等［29］也發(fā)現(xiàn)一些微囊藻藻株含有mcy基因，但是不產(chǎn)微囊藻毒素.Kaebernick等［30］推測，這可能是由于微囊藻在生長過程中，mcy基因簇突變.Kurmayer等［31］對Planktothix rubescens產(chǎn)毒基因和產(chǎn)毒能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，P.rubescens的產(chǎn)毒基因與產(chǎn)毒能力并不一致.

致謝:感謝中國科學(xué)院水生生物研究所有害藻類學(xué)科組老師和同學(xué)們在實(shí)驗(yàn)中給予的寶貴意見和建議，保證實(shí)驗(yàn)順利完成.在此向他們致以我最真摯的謝意.

［1］施麗梅，蔡元鋒，楊華林等.太湖梅梁灣水華微囊藻基因型組成和產(chǎn)毒微囊藻豐度的變化.湖泊科學(xué)，2009，21(6):801-805.

［2］邵繼海.生物源物質(zhì)和溶藻菌對銅綠微囊藻抑制作用機(jī)理研究［學(xué)位論文］.武漢:中國科學(xué)院水生生物研究所，2010.

［3］Pouria S，Andrade A，Barbosa J et al.Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru.Lancet，1998，352:21-26.

［4］虞功亮，宋立榮，李仁輝.微囊藻屬常見種類的分類學(xué)討論——以滇池為例.植物分類學(xué)報，2007，45(5):727-741.

［5］虞功亮，李仁輝.中國淡水微囊藻三個新記錄種.植物分類學(xué)報，2007，45(3):353-358.

［6］吳忠興.我國微囊藻多樣性分析及其種群優(yōu)勢的生理學(xué)機(jī)制研究［學(xué)位論文］.武漢:中國科學(xué)院水生生物研究所，2006.

［7］劉海林，章 群，李名立等.太湖與廣東湯溪水庫微囊藻gyrB基因序列分析.湖泊科學(xué)，2010，22(2):221-226.

［8］郭春燕，李 砧，謝樹蓮.太原市汾河景區(qū)浮游藻類及水質(zhì)評價研究.山西大學(xué)學(xué)報，2006，29(2):205-208.

［9］Kasai F，Kawachi M，Erata M et al.NIES-Collection，List of Strains，seventh ed.National Institute for Environmental Studies Tsukuba，2004:257.

［10］Neilan BA，Jacobs D，Goodman AE.Genetic Diversity and Phylogeny of Toxic Cyanobacteria Determined by DNA Polymorphisms within the Phycocyanin Locus.Appl Environ Microbiol，1995，61(11):3875-3883.

［11］Yoshida M，Yoshida T，Satomi M et al.Intra-specific phenotypic and genotypic variation in toxic cyanobacterial Microcystis strains.J Appl Microbiol，2008，105:407-415.

［12］Hisbergues M，Christiansen G，Rouhiainen L et al.PCR-based identification of microcystin-producing genotypes of different cyanobacterial genera.Arch Microbiol，2003，180:402-410.

［13］Otsuka S，Suda S，Li RH et al.Morphological variability of colonies of Microcystis morpho-species in culture.J Gen Appl Microbiol，2000，46:39-50.

［14］雷臘梅，甘南琴，張小明等.三種檢測微囊藻毒素的ELISA方法比較研究.高技術(shù)通訊，2004，7:89-92.

［15］胡鴻鈞，魏印心編著.中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài).北京:科學(xué)出版社.2006:62-68.

［16］Wu ZX，Gan NQ，Song LR.Genetic diversity:Geographical distribution and toxin profiles of Microcystis strains(Cyanobacteria)in China.J Integr Plant Biol，2007，49(3):262-269.

［17］Briand E，Escoffier N，Straub C et al.Spatiotemporal changes in the genetic diversity of a bloom-forming Microcystis aeruginosa(cyanobacteria)population.ISME J，2009，3:419-429.

［18］Sabart M，Pobel D，Latour D et al.Spatiotemporal changes in the genetic diversity in French bloom-forming populations of the toxic cyanobacterium，Microcystis aeruginosa.Environ Microbiol Rep，2009，1(4):263-272.

［19］陳月琴，何家菀，莊麗等.二種淡水微囊藻rDNA 16S-23S基因間隔區(qū)的序列測定與分析.水生生物學(xué)報，1999，23(1):41-46.

［20］Otsuka S，Suda S，Li RH et al.Phylogenetic relationships between toxic and nontoxic strains of the genus Microcystis based on 16S to 23S internal transcribed spacer sequence.FEMS Microbiol Lett，1999，172:15-21.

［21］謝 平.微囊藻毒素對人類健康影響相關(guān)研究的回顧.湖泊科學(xué)，2009，21(5):603-613.

［22］張維吳，徐小清.固相萃取高效液相色譜法測定水中痕量微囊藻毒素.分析化學(xué)研究報告，2001，29(5):522-525.

［23］楊松芹，巴 月，張慧珍等.鄭州市主要生活飲用水源中微囊藻細(xì)胞的分離培養(yǎng)與毒性鑒定.鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008，43(1):95-97.

［24］Watanabe MF，Oishii S.Effects of Environmental Factors on Toxicity of a Cyanobacterium(Microcystis aeruginosa)under Culture Conditions.Appl Environ Microbiol，1985，49(5):1342.

［25］Wicks RJ，Thiel PG.Environmental Factors Affecting the Production of Peptide Toxins in Floating Scums of Cyanobacterium Microcystis Aeruginosa in a Hypertrophic African Reservoir.Environ Sci Technol，1990，24(9):1413-1418.

［26］何振榮，何家菀，李仁輝等.武漢東湖銅綠微囊藻毒株M.8641的毒性與生長、溫度的關(guān)系.水生生物學(xué)報，1990，14(4):343-349.

［27］連 民，劉 穎，俞順章.氮、磷、鐵、鋅對銅綠微囊藻生長及產(chǎn)毒的影響.上海環(huán)境科學(xué)，2001，20(4):166-170.

［28］Bozarth CS，Schwartz AD，Shepardson JW et al.Population Turnover in a Microcystis Bloom Results in Predominantly Nontoxigenic Variants Late in the Season.Appl Environ Microbiol，2010，76(15):5207-5213.

［29］Mikalsen B，Boison G，Skulberg OM et al.Natural Variation in the Microcystin Synthetase Operon mcyABC and Impact on Microcystin Production in Microcystis Strains.J Appl Bacteriol，2003，185(9):2774-2785.

［30］Kaebernick M，Rohrlack T，Christoffersen K.A spontaneous mutant of microcystin biosynthesis:genetic characterization and effect on Daphnia.Environ Microbiol，2001，3:669-679.

［31］Kurmayer R，Christiansen G，F(xiàn)astner J et al.Abundance of active and inactive microcystin genotypes in populations of the toxic cyanobacterium Planktothrix spp.Environ Microbiol，2004，6(8):831-841.

Molecular diversity and microcystin production of Microcystis in Fenhe River of Taiyuan

WANG Jie1，2，XIE Shulian1，WANG Zhongjie2，XU Yao2＆ LI Renhui2
(1:School of Life Science，Shanxi University ，Taiyuan 030006，P.R.China)
(2:Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，P.R.China)

To study the molecular diversity of Microcystis in Fenhe River of Taiyuan，phylogenetic analyses based on ITS、PC-IGS and gyrB genes were performed from 7 isolated strains of Microcystis.These seven Microcystis strains formed distinct lineages，suggesting high diversity of Microcystis.ELISA and whole-cell PCR targeting microcystin synthetase gene(mcyA)were used to determine microcystin production.Results showed that six of the seven strains contain mcyA gene and the microcystin concentrations of the six Microcystis strains ranged from 0.003mg/g to 0.043mg/g.This is the first report of toxic Microcystis in Fenhe River，and it is urgent that more critical measures should be taken for the protection of Fenhe River.

Fenhe River;Microcystis;molecular diversity;microcystin

＊ 中國科學(xué)院“百人計劃”項(xiàng)目(082303-1-501)資助.2010-10-19收稿;2011-01-10收修改稿.王捷，男，1984年生，碩士研究生;E-mail:wangjie901@126.com.

＊＊ 通訊作者;E-mail:reli@ihb.ac.cn.