抗生素抗性組學(xué)研究進(jìn)展

徐春燕,蘇建強(qiáng),鄢慶枇,馬 英

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021;2.中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所,城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021)

抗生素抗性組學(xué)研究進(jìn)展

徐春燕1,2,蘇建強(qiáng)2,鄢慶枇1,馬 英1

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021;2.中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所,城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021)

抗生素抗性問(wèn)題已成為當(dāng)前國(guó)際上的研究熱點(diǎn)之一.對(duì)抗生素抗性組學(xué)的內(nèi)涵、研究意義及國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,并論述了宏基因組學(xué)技術(shù)在抗性組學(xué)研究方面的應(yīng)用,這有助于促進(jìn)國(guó)內(nèi)開(kāi)展相關(guān)方面的研究.

抗生素抗性;抗生素抗性基因;抗生素抗性組學(xué);宏基因組學(xué)

抗生素是 20世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一,自其被發(fā)現(xiàn)以來(lái),它在醫(yī)療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,對(duì)控制人類(lèi)感染性疾病發(fā)揮了巨大的作用.與此同時(shí),由于獸藥抗生素具有防治動(dòng)物疫病和促進(jìn)生長(zhǎng)的雙重功效,因此,在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中,常以亞治療劑量長(zhǎng)期添加于動(dòng)物飼料中.目前,在全球范圍內(nèi)幾乎所有地區(qū)都采用抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)追求產(chǎn)量、提高經(jīng)濟(jì)效益的目的[1].

然而,由于抗生素的大量使用使許多細(xì)菌獲得了耐藥性,導(dǎo)致抗生素的治療效果日益下降,許多疾病的救治顯得越來(lái)越棘手.近年來(lái),臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不斷發(fā)生由抗生素抗藥性造成對(duì)一些致病菌無(wú)法有效控制的惡性事件.其實(shí),早在 20世紀(jì) 60年代抗生素第一次進(jìn)入臨床應(yīng)用之前,就分離到抗性細(xì)菌.隨著抗生素的使用,抗性細(xì)菌在數(shù)量、多樣性以及抗性強(qiáng)度上都顯著增大[2].目前,每種抗生素在臨床的使用上都有其抗性細(xì)菌,多重耐藥菌株的檢出也相當(dāng)普遍,甚至出現(xiàn)了能抵抗絕大多數(shù)抗生素的“超級(jí)細(xì)菌”,為濫用抗生素敲響了警鐘.抗生素抗性已成為一個(gè)醫(yī)學(xué)難題.研究發(fā)現(xiàn),許多細(xì)菌是通過(guò)抗生素抗性基因 (Antibiotic resistance genes,ARGs)來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗藥性機(jī)理的[3-4],但對(duì)于細(xì)菌,尤其是環(huán)境細(xì)菌抗性基因的起源、分布和多樣性,尚不清楚[5].

抗生素抗性組 (Antibiotic resistome)是 2006年W right等人提出的新名詞,是指微生物中所有抗生素抗性基因的集合[6].此后,抗性組學(xué)的方法便廣泛用來(lái)研究土壤、豬糞、活性污泥等各種環(huán)境中的抗性基因[5,7-8].本文綜述了抗性基因污染持續(xù)殘留和廣泛擴(kuò)散的特點(diǎn),并詳述了抗性基因研究的新方法—抗性組學(xué)方法的內(nèi)涵和研究程序,使人們對(duì)抗性以及抗性基因有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí),為促進(jìn)國(guó)內(nèi)開(kāi)展相關(guān)方面的研究,進(jìn)而研制新的抗菌藥物,減少抗性帶來(lái)的負(fù)面影響提供了參考.

1 抗生素抗性基因 (ARGs)——一種新型環(huán)境污染物

研究表明,用于預(yù)防與治療人類(lèi)和動(dòng)物感染的抗生素,包括促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物快速增長(zhǎng)的促進(jìn)劑,只有15%可被吸收利用,大約 85%未被代謝而隨排泄物直接排放至環(huán)境中[9].因此,養(yǎng)殖廢水、醫(yī)院廢水的排放可導(dǎo)致環(huán)境中的抗生素濃度升高,從而誘導(dǎo)抗性基因;另外,長(zhǎng)期使用抗生素的人類(lèi)和動(dòng)物,其體內(nèi)編碼的抗性基因的抗性菌株也隨腸道細(xì)菌被排出體外,抗性基因也隨之進(jìn)入環(huán)境.獸藥抗生素和醫(yī)用抗生素誘導(dǎo)出的抗性基因是環(huán)境中抗性基因污染的主要來(lái)源,隨著抗菌藥物的開(kāi)發(fā)和使用,抗性基因在抗生素的選擇壓力下得到進(jìn)化,其編碼的產(chǎn)物對(duì)新藥的耐藥性逐漸增加.這些抗性基因具有很高的遷移性和活性,可通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件,如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子及基因組島等,在同種甚至于不同種菌株間水平轉(zhuǎn)移,使得抗性基因在環(huán)境中廣為傳播,造成二次污染[1,10].這種方式獲得的抗藥性機(jī)率高,形成后較穩(wěn)定,是引起抗藥性傳播的主要原因[11].研究表明,一些未受人類(lèi)影響的偏遠(yuǎn)地區(qū)以及未施用抗生素的人或動(dòng)物體內(nèi),存在與致病菌相同的抗性基因[5,7,12].這說(shuō)明,ARGs在環(huán)境中普遍存在,而日益增長(zhǎng)的抗生素選擇壓力加速了 ARGs的水平轉(zhuǎn)移,甚至在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[13].環(huán)境中的抗性菌可能會(huì)將抗性基因轉(zhuǎn)移到人體的病原菌,增加人致病菌的抗生素耐藥性,使細(xì)菌感染性疾病的治療更加棘手.另外,攜帶 ARGs的微生物菌株死亡后,攜帶 ARGs的裸露 DNA可釋放到環(huán)境,在特定成分的土壤或粘土中長(zhǎng)期存在,而不被環(huán)境中脫氧核糖核酸酶 (DNAase)降解,環(huán)境中這些裸露的 DNA分子又可轉(zhuǎn)入到其他生物體細(xì)胞內(nèi)[14-16],造成抗性基因的傳播和擴(kuò)散.ARGs的存在和快速傳播對(duì)人類(lèi)健康及養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的威脅.

研究表明[17],ARGs存在于各種環(huán)境中,包括河流沉積物、灌溉渠、牛奶加工廠的出水、污水處理廠污水回用的排污渠以及飲用水處理廠,并且人為活動(dòng)干擾的環(huán)境介質(zhì)中抗性基因的濃度明顯高于未受到人類(lèi)干擾地區(qū).基于上述研究結(jié)果,Pruden等人首次提出將 ARGs作為一種環(huán)境污染物.ARGs具有持續(xù)殘留和廣泛擴(kuò)散的特點(diǎn),這些特點(diǎn)使其具有重大的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),理應(yīng)將 ARGs作為一類(lèi)新型環(huán)境污染物,并給予足夠重視.

2 抗生素抗性組的內(nèi)涵及研究意義

以前,抗生素抗性研究的重點(diǎn)在于臨床病原菌的抗性機(jī)制,但是,這些研究無(wú)法分析抗性基因的來(lái)源和進(jìn)化.了解抗性基因的起源和進(jìn)化是一項(xiàng)非常艱巨的任務(wù),目的是為了將來(lái)制造出讓細(xì)菌無(wú)法產(chǎn)生抗性的藥物.更廣闊的視角應(yīng)該是對(duì)所有抗性基因——包括病原菌和非病原菌抗性基因,甚至是潛在的抗性基因進(jìn)行研究[2].2006年,W right等人提出將微生物中所有ARGs的集合叫做抗生素抗性組 (Antibiotic resistome)(圖 1)[6].致病菌攜帶的抗性基因只占抗性組很小的一部分,抗性組還包括抗生素生產(chǎn)者攜帶的抗性基因、隱秘的抗性基因 (Cryptic embedded genes)以及前體基因 (Precursor genes).隱秘的抗性基因是指嵌入到細(xì)菌染色體上,但通常不表達(dá)或表達(dá)水平很低的基因.前體基因可以編碼有適度抗生素抗性活性或與抗生素密切相關(guān)的蛋白質(zhì),在一定的選擇壓力下,這種基因可以進(jìn)化為有效的抗性基因,它們是抗生素抗性的最終外部來(lái)源.

抗性組概念的提出對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要影響:首先,雖然體內(nèi)共生微生物是引起感染的主要原因,但環(huán)境細(xì)菌潛在的抗藥性要比共生菌強(qiáng);另外,臨床上發(fā)現(xiàn)的抗性很多都源于環(huán)境抗性基因.過(guò)去 60年里,抗菌藥物的廣泛使用已經(jīng)為環(huán)境中高抗性基因轉(zhuǎn)移到病原菌提供了必要條件.所以有必要拓寬對(duì)于抗性基因的研究范圍,將抗性基因的研究擴(kuò)大到廣闊的環(huán)境中,更多地了解全球抗性的流行和多樣性[18],為發(fā)現(xiàn)新的抗性基因,了解新的抗性機(jī)制,研發(fā)新的抗生素提供理論依據(jù).同時(shí),抗性組的研究能夠?yàn)榭股乜剐越M提供預(yù)警機(jī)制,當(dāng)某種抗性出現(xiàn)在臨床上時(shí),能夠指導(dǎo)采取正確的診斷技術(shù)和治療策略.

圖1 抗生素抗性組[6]注:抗生素抗性組由所有的 ARGs組成,包括病原菌攜帶的抗性基因、抗生素生產(chǎn)者攜帶的抗性基因、隱秘的嵌入基因以及前體基因.出現(xiàn)在臨床病原菌中的抗性基因,有一些與隱秘的抗性基因及抗生素生產(chǎn)者攜帶的抗性基因相似,因此這 3個(gè)集合有部分重疊.

3 抗生素抗性組學(xué)研究進(jìn)展

大量的研究表明,臨床上的抗生素抗性基因與環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的抗性基因密切相關(guān)[18],環(huán)境 (包括非臨床環(huán)境)是抗性基因的儲(chǔ)庫(kù),而已知的抗性基因大部分來(lái)自臨床病原體,對(duì)于非臨床環(huán)境中的抗性基因則還未做充分研究[2].當(dāng)前,隨著分子生物學(xué)手段的發(fā)展和不斷完善,它在方法學(xué)上為抗生素抗性組的研究提供了極大的可能性.

早期對(duì)抗性基因的研究主要是從分離培養(yǎng)的細(xì)菌中獲得抗性基因,這種方法存在一定的局限性,自然環(huán)境中的大部分微生物至今仍無(wú)法培養(yǎng)[19],通過(guò)傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)細(xì)菌方法所獲得的抗性基因只是抗性組的一部分.目前,應(yīng)用較多的 PCR方法可以直接從環(huán)境樣品中獲得未培養(yǎng)細(xì)菌的抗性基因[20].Schmitt等人通過(guò) PCR證明了土壤中四環(huán)素抗性基因的多樣性[21].Chee-Sanford采用 PCR-DGGE和序列分析技術(shù)在養(yǎng)豬場(chǎng)附近的糞池中發(fā)現(xiàn)了 8種四環(huán)素抗性基因,分別為 tet(O)、tet(Q)、tet(w)、tet(M)、tetB(P)、tet(S)、tet(T)和 otr A[22].PCR技術(shù)的局限性在于它僅僅能得到與已知序列相似的基因,通常不能得到新的抗性基因[20].

宏基因組 (Metagenome)是 Handelsman等[23]于 1998年提出的新名詞,是指生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和,既包含了可培養(yǎng)的又包含了未能培養(yǎng)的微生物基因.宏基因組學(xué)的方法是直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的 DNA,構(gòu)建宏基因組文庫(kù),并以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段,研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物功能基因的多樣性和進(jìn)化關(guān)系.這種方法克服了分離培養(yǎng)和 PCR兩種方法的局限性,能方便、快捷地獲得抗性組以及新的抗性基因,極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間,能廣泛地應(yīng)用于抗性組的研究.

2004年,Riesenfeld等人[20]直接從土壤樣品中提取 DNA,構(gòu)建了 6個(gè)宏基因組文庫(kù),共包含 5.4 Gb的土壤DNA,篩選出 9個(gè)表達(dá)氨基糖苷類(lèi)抗生素抗性的克隆子和 1個(gè)表達(dá)四環(huán)素抗性的克隆子,除了一個(gè)抗性基因之外,其余所有抗性基因所編碼的氨基酸序列都與先前報(bào)道的序列明顯不同 (相似度 <60%),這說(shuō)明土壤是抗性基因的儲(chǔ)庫(kù),通過(guò)宏基因組學(xué)的方法可以發(fā)現(xiàn)新的抗性基因,能客觀反映環(huán)境中抗性基因的多樣性,這是第一次關(guān)于運(yùn)用宏基因組學(xué)的方法來(lái)研究抗性基因的報(bào)道.Sommer等人[13]采集了 2個(gè)健康人體的唾液和排泄物來(lái)研究人類(lèi)口腔和腸道微生物的抗性基因.首先,構(gòu)建 2個(gè)大小為 9.3×109bp的宏基因組文庫(kù),進(jìn)行 13種抗生素的功能篩選,并對(duì)篩選得到的抗性克隆子進(jìn)行測(cè)序,所得序列與已知病原菌抗性基因平均相似度為 60.7%;而同時(shí)進(jìn)行的通過(guò)培養(yǎng)方法獲得的抗性基因,其中有 95%與已知病原菌抗性基因的相似度超過(guò) 90%,有幾乎一半的基因與已知抗性基因的相似度為 100%.Mori等人[8]構(gòu)建了活性污泥的宏基因組文庫(kù),大小為 3.2 Gb,并篩選了博來(lái)霉素抗性基因,發(fā)現(xiàn) 2個(gè)博來(lái)霉素抗性基因 (4H7,7A10)具有很大差異,并且不同于博來(lái)霉素產(chǎn)生菌和臨床上抗性菌株攜帶的抗性基因.Allen等人[5]對(duì)偏遠(yuǎn)的阿拉斯加的土壤進(jìn)行了宏基因組學(xué)的分析,發(fā)現(xiàn)盡管沒(méi)有人為活動(dòng)的干擾,未被污染地區(qū)的土壤微生物群落也攜帶β-內(nèi)酰胺抗生素抗性基因.功能篩選和日益增長(zhǎng)的宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)揭示了環(huán)境中的抗性基因水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出預(yù)料[18],非臨床環(huán)境是新的抗性基因的巨大儲(chǔ)庫(kù).

4 研究展望

目前,對(duì)于抗性組的研究主要集中于土壤環(huán)境,其原因在于土壤為抗性基因的巨大儲(chǔ)庫(kù).首先,大多數(shù)抗生素是由土壤放線菌產(chǎn)生的,抗生素生產(chǎn)者都攜帶具有自我保護(hù)作用的抗生素抗性基因,這些基因與臨床抗性病原菌中發(fā)現(xiàn)的可移動(dòng)遺傳因子同源;其次,多數(shù)抗生素未被人或動(dòng)物代謝而直接排出體外,攜帶抗性基因的抗性菌株也隨之排出,其糞便首先進(jìn)入土壤,之后隨著抗性基因的水平轉(zhuǎn)移,使得抗性基因在各種環(huán)境中廣泛傳播.

研究表明,抗性基因已廣泛存在于整個(gè)微生物界,除了土壤抗生素抗性組,對(duì)于其他環(huán)境中抗性基因的研究也是必要的,例如,水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境、地下水系統(tǒng)、河流沉積物甚至未施用抗生素或未受人類(lèi)影響的環(huán)境.因此應(yīng)擴(kuò)大抗性組的研究范圍,探索環(huán)境系統(tǒng)中抗性基因的多樣性和進(jìn)化關(guān)系,以促進(jìn)新一代抗菌藥物的研發(fā);甚至還可以根據(jù)抗性組來(lái)預(yù)測(cè)未來(lái)可能出現(xiàn)的抗生素抗性[24],以此來(lái)指導(dǎo)正確的治療措施.

國(guó)內(nèi)對(duì)于環(huán)境中ARGs的研究才剛剛起步[1],有關(guān)抗性組學(xué)的報(bào)道更未見(jiàn)到,還有很多的問(wèn)題亟待解決 ,例如:

1)除了基因突變以及基因水平轉(zhuǎn)移外,是否還存在其他尚未發(fā)現(xiàn)的能促使 ARGs在環(huán)境中持久存在并廣泛傳播的因素?

2)基因的水平轉(zhuǎn)移使得環(huán)境細(xì)菌獲得了抗生素抗性,那么是什么因素促使了基因的水平轉(zhuǎn)移?是否可以通過(guò)控制這種因素來(lái)抑制基因的水平轉(zhuǎn)移?

3)臨床上發(fā)現(xiàn)的ARGs有一些與環(huán)境細(xì)菌攜帶的抗性基因極為相似,但兩者的關(guān)系及環(huán)境中的抗性基因進(jìn)入人類(lèi)致病菌的機(jī)制尚不清楚.

4)ARGs在細(xì)菌細(xì)胞中除了編碼抗生素抗性外,是否還有其他功能?

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Research Progresses of Antibiotic Resistom ics

XU Chun-yan1,2,SU Jian-qiang2,YAN Qing-pi1,MA Ying1

(1.The KeyLaboratory of Fujian’s Higher Institutions for Green Foods and the Science and Technology ofAquaculture,Fisheries College,JimeiUniversity,Xiamen 361021,China;2.The KeyLaboratory of Environment and Health in Cities,The Urban Environmental Institute in Chinese Academy of Sciences,Xiamen 361021,China)

Over the last decades,there has been growing concerns on antibiotic resistance. In the paper,the connotation,research significance and research progresses of the antibiotic resistomics were reviewed,and the application ofmetagenomic in the study of antibiotic resistome was discussed.The review will be helpful for the research in related fields.

antibiotic resistance;antibiotic resistance genes(ARGs);antibiotic resistomics;metagenomics

X 171 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

A

1004-1729(2011)02-0188-05

2011-01-19

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31070101);近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (廈門(mén)大學(xué))開(kāi)放基金(MEL0701);集美大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金 (2010A003)

徐春燕 (1986-),女,山東泰安人,集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 2008級(jí)碩士研究生.

馬英,女,博士,副教授.E-mail:maying@jmu.edu.cn