程春鳳,楊 智,李 壯,黃昕艷,江清林

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154002;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江佳木斯154003;3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯154007)

比較四種消化方法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞傳代增殖及活性的影響

程春鳳1,楊 智1,李 壯2,黃昕艷1,江清林3

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154002;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江佳木斯154003;3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯154007)

目的:觀察4種消化方法對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖及活性的影響。方法:原代培養(yǎng)新生大鼠海馬NSCs,采用機(jī)械消化、0.25%單純胰酶、0.25%胰酶+0.02%EDTA 和0.02%EDTA 4種不同消化方法對(duì)NSCs球進(jìn)行傳代培養(yǎng),經(jīng)四唑鹽比色法(MTT法)法檢測(cè)不同方法對(duì)NSCs活性及增殖能力的變化。結(jié)果:與機(jī)械消化相比,0.25%單純胰酶組,0.25%胰酶+EDTA組消化后的大鼠海馬NSCs球長(zhǎng)時(shí)間不聚集,細(xì)胞增殖停頓,而單純EDTA組則明顯提高了NSCs的增殖及活性,其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),單純0.02%EDTA組能夠顯著提高體外培養(yǎng)的大鼠海馬NSCs的增殖水平及活力,且對(duì)細(xì)胞的后續(xù)損傷相對(duì)較小。

神經(jīng)干細(xì)胞;原代培養(yǎng);胰酶;EDTA;MTT法

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是一種能產(chǎn)生神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞,它的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展,徹底改變了以往認(rèn)為中樞神經(jīng)不能再生的認(rèn)識(shí),為神經(jīng)發(fā)育研究與神經(jīng)組織移植開(kāi)辟了廣闊的前景。因NSCs具有多向分化潛能,決定了它在神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)治療中,可以通過(guò)NSCs移植或體內(nèi)激活,分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,與已經(jīng)存在的細(xì)胞結(jié)構(gòu)整合到一起,成為治療腦脊髓損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病如阿爾茨海默病、帕金森病等最為理想的原材料[1,2]。為此,前人對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及促進(jìn)其增殖方面作出了大量不懈的努力[3,4],本研究對(duì)NSCs傳代培養(yǎng)時(shí)的傳統(tǒng)消化方法進(jìn)行改良,細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)并得到了較高的得率。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生24h以內(nèi)Wistar大鼠,由佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(黑)2006-004]。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、B27添加劑、胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;大鼠基因重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)購(gòu)于美國(guó)Pepro Tech公司;青霉素及鏈霉素購(gòu)于哈藥總廠;0.25%單純胰酶、0.02%EDTA和0.25%胰酶+0.02%EDTA混合液、臺(tái)盼藍(lán)、噻唑蘭(MTT)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司、Nestin、NSE、GFAP一抗購(gòu)于北京博奧森公司;Cy3二抗、大鼠SABC大鼠試劑盒、DHanks液、PBS液、4%多聚甲醛購(gòu)于武漢博士德公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Sheldon公司);XSZ-D型相差倒置顯微鏡(日本O lympus公司)。

2 方法

2.1 NSCs原代培養(yǎng)

常規(guī)分離新生Wistar大鼠海馬,D-Hanks液漂洗,充分剪碎,用吸管吹打成單細(xì)胞懸液,以5×105/L密度接種于培養(yǎng)瓶中,加入NSCs完全培養(yǎng)液(含DMEM/F12、bFGF、EGF、B27和青鏈雙抗)再次制成細(xì)胞懸液,臺(tái)盤(pán)蘭染色計(jì)數(shù)后以1×106/mL密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),3d后離心、半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)到第7d,待形成大量100～200個(gè)細(xì)胞左右的NSCs球時(shí),進(jìn)行消化傳代。

2.2 NSCs分組消化和傳代培養(yǎng)

將培養(yǎng)瓶中NSCs調(diào)整為5×105個(gè)/mL接種于4個(gè)小離心管中,每管接種1mL。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組:A組為單純機(jī)械吹打組,B組為為0.25%胰酶組,C組0.25%胰酶+EDTA組,D組為0.02%EDTA組。A組各孔用尖頭吸管反復(fù)吹打5min;B-D組各孔分別加入等體積的消化液后37℃孵育5min,中間用尖頭吸管吹打2～3次,含胰酶組用血清終止消化,最后將4管細(xì)胞懸液全部離心棄上清,再用完全培養(yǎng)液重懸。

2.3 MTT法檢測(cè)各組NSCs活性

將2.2中4組NSCs重懸液,以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積200μL,37℃ 5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每天連續(xù)觀察各組NSCs增殖數(shù)量及細(xì)胞狀態(tài),連續(xù)計(jì)數(shù)7d后繪制生長(zhǎng)曲線。分別于培養(yǎng)3d、5d和7d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力(8孔/組·時(shí)間點(diǎn)),具體方法:向每孔加入MTT溶液20μL,37℃繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng),將孔內(nèi)細(xì)胞離心收集(1000r/min 5min),每孔加入150μLDMSO,震蕩10min,用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光值(A值)。取每組消化方法8孔的吸光值均數(shù),試驗(yàn)重復(fù)三次,計(jì)算其平均值。計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=T/D×100%(T和D分別為測(cè)定孔何對(duì)照孔細(xì)胞的光密度平均值)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料采用±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜ 0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 NSCs原代培養(yǎng)

倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)海馬NSCs單細(xì)胞懸浮生長(zhǎng),密度較均勻,基本無(wú)貼壁現(xiàn)象(見(jiàn)圖1-A);24h后發(fā)現(xiàn)NSCs克隆,以后克隆逐漸增大(見(jiàn)圖1-B);到第3天聚集成圓球形,漂浮生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶中,折光性好,大小不等(見(jiàn)圖1-C);到第7天克隆到數(shù)百個(gè)細(xì)胞,形成所謂的神經(jīng)球。此刻的神經(jīng)球立體感及折光性均強(qiáng),邊界清晰。組成神經(jīng)球的細(xì)胞圓潤(rùn)飽滿,活力狀態(tài)好(見(jiàn)圖1-D)。

3.2 N SC分組消化和傳代培養(yǎng)

不同消化方法傳代結(jié)果顯示:單純0.02%EDTA組較機(jī)械消化組細(xì)胞球容易吹打開(kāi),且細(xì)胞多為大小均勻一致的小細(xì)胞球;單純機(jī)械消化后細(xì)胞球直徑大小差異大,小細(xì)胞球被吹打?yàn)閱渭?xì)胞時(shí),大直徑細(xì)胞球仍未吹打開(kāi);0.25%胰酶組及0.25%的胰酶+0.02%EDTA組消化時(shí)間及程度難以掌握,消化后單細(xì)胞較多,且長(zhǎng)時(shí)間不聚集,細(xì)胞增殖停頓。由細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(見(jiàn)圖2)及MTT檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表1)顯示單純0.02%EDTA組神經(jīng)干細(xì)胞的活力好于其余三組,細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。傳代后1～3d細(xì)胞增殖數(shù)差別不大,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),各組細(xì)胞增殖數(shù)差別顯著,單純0.02%EDTA組對(duì)細(xì)胞的后續(xù)損傷相對(duì)較小。

圖1 NSCs原代培養(yǎng)(200×)

圖2 不同消化傳代方法NSCs生長(zhǎng)曲線

表1 不同消化傳代方法NSCs存活率 (±s,n=8)

表1 不同消化傳代方法NSCs存活率 (±s,n=8)

注:與機(jī)械消化組比較,＊、＊＊、＊＊＊P＜ 0.05;其余組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

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4 討論

在NSCs原代培養(yǎng)傳代有機(jī)械消化和胰酶消化兩大類方法,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),機(jī)械消化法可以得到雜質(zhì)比較少的單細(xì)胞懸液,對(duì)細(xì)胞的損傷程度較小,但在遇到NSCs球直徑較大時(shí),機(jī)械消化法效果不理想,難以將細(xì)胞球吹打開(kāi)。我們選用0.25%胰酶和0.02%EDTA進(jìn)行消化,其作用機(jī)理:EDTA是一種螯合劑,因?yàn)榧?xì)胞表面很多相互結(jié)合的蛋白都是帶有鈣離子或鎂離子的蛋白,而EDTA可以螯合鈣離子或者鎂離子,從而加速細(xì)胞間相脫離。胰酶是一種蛋白酶,在特定的位置降解蛋白,可以將細(xì)胞膜上相互結(jié)合的蛋白降解,從而使細(xì)胞與細(xì)胞分離,缺點(diǎn)是消化的時(shí)間和程度很難掌握,消化過(guò)度的話細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間呈單細(xì)胞懸液狀態(tài),很難聚集,且接近無(wú)增殖狀態(tài),此種現(xiàn)象是細(xì)胞膜受損所致。為了細(xì)胞能更好的生長(zhǎng),我們?cè)噲D尋找更好的消化方法,在本實(shí)驗(yàn)中我們把NSCs分為機(jī)械消化組,0.25%胰酶+EDTA組,0.25%胰酶組,0.02%EDTA組。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及MTT檢測(cè)結(jié)果顯示單純0.02%EDTA組NSCs活力好于其余三組,細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示,神經(jīng)干細(xì)胞球中幾乎所有細(xì)胞呈nestin陽(yáng)性表達(dá)。

[1]朱曉峰,董為偉.神經(jīng)干細(xì)胞特性及其在神經(jīng)疾病中的應(yīng)用[J].中華神經(jīng)科雜志,2001,34(4):248-249

[2]Gross C G.Neurogenesis in the adult brain:death of a dogma[J].Nat Rev Neurosci,2000,1(1):67-73

[3]顧恩妍,哈福,李林風(fēng),等.神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法介紹[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(11):53-57

[4]李峰,劉玉光,朱樹(shù)干,等.機(jī)械分離與胰酶消化分離對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生能力的影響[J].山東醫(yī)藥,2008,48(21):22-25

Compare the effect of four kinds of digestion methods to the proliferation and activity of the neural stemcell passage

CHENG Chun-feng1,YANG Zhi1,LI Zhuang2,HUANG Xin-yan1,JIANG Qing-lin3
(1.Department of Neurology,The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154002,China;2.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China;3.Jiamusi Basic Medical University,Jiamusi 154007,China)

Objective:To observe the four kinds of digestion of NSCs in vitro proliferation and activity.Methods:Primary culture of neonatal Wistar rat hippocampal NSCs,mechanical separation,0.25%pure trypsin,0.02% EDTA and 0.25% trypsin+0.02% EDTA 4 different digestion methods NSCs ball subculture,the four methyl thiazolyl tetrazolium assay(MTT)method for detection of four kinds of digestive activity and proliferation of NSCs changes.Results:Compared with the mechanical digestion,0.25%trypsin alone group,0.25%trypsin+EDTA group after digestion in rat hippocampalNSCs do not gather the ball for a long time,cell proliferation stopped,and proliferation of NSCs and activity were significantly increased by pure EDTA group,which makes no significant difference in the other groups.Conclusion:With the cultivate time extended,pure 0.02%EDTA group can significantly improve the in vitro proliferation of hippocampal NSCs level and vitality,and the subsequent damage to the cells is relatively small.

neural stem cells;primary cultivate;trypsin;EDTA;MTT method

Q 25;R329.2+7

A

1008-0104(2012)02-0001-02

2011-01-06)

黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目,編號(hào):YJSCX2011-387HLJ;黑龍省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目,編號(hào):2010-531;黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目,編號(hào):12521543。

程春鳳(1963～)女,黑龍江海倫人,主任醫(yī)師,教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)與應(yīng)用。

江清林(1964～)男,黑龍江林口人,碩士,研究員,研究生導(dǎo)師。E-mail:hljyykx@163.com。