劉國(guó)生，王建琨，邢善濤，王海磊，陳 琳，王玉娟

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000)

紙色譜-分光光度法測(cè)定生物轉(zhuǎn)化體系中脫氧腺苷含量

劉國(guó)生1，王建琨1，邢善濤2，王海磊1，陳 琳1，王玉娟1

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000)

目的 建立紙色譜-分光光度法測(cè)定生物轉(zhuǎn)化液中脫氧腺苷(dAR)含量。方法 用不同極性的展開(kāi)劑進(jìn)行紙色譜從混合物中分離dAR，分光光度法測(cè)定分離的dAR濃度。結(jié)果 測(cè)試了4種展開(kāi)劑對(duì)dAR的分離效果，發(fā)現(xiàn)用展開(kāi)劑正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)一次色譜可將dAR與其它成分分離。將分離并重新溶解的dAR在258 nm處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中的產(chǎn)物濃度。結(jié)論 該法測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果一致，是一種簡(jiǎn)易有效的快速測(cè)定生物轉(zhuǎn)化體系中dAR含量的方法。

脫氧腺苷;生物轉(zhuǎn)化;紙色譜;展開(kāi)劑;分光光度法

核苷類(lèi)化合物是開(kāi)發(fā)合成新型抗病毒、抗腫瘤藥物的一類(lèi)重要原料，目前有近50%的抗病毒藥物屬于核苷類(lèi)藥物，如阿昔洛韋、阿糖腺苷、利巴韋林等［1］;許多抗腫瘤藥物也屬于核苷類(lèi)藥物，如阿糖胞苷、去氧氟尿苷等。這些藥物可通過(guò)化學(xué)或生物方法合成［2-3］。本實(shí)驗(yàn)室利用產(chǎn)生核苷磷酸化酶［4-5］的微生物將底物脫氧胸苷(dTR)轉(zhuǎn)化為脫氧腺苷(dAR)，以作為合成其它藥物的中間體［6-7］。轉(zhuǎn)化體系中有兩種底物和兩種產(chǎn)物，建立對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行快速定性和定量分析方法是優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的基礎(chǔ)。測(cè)定dAR的方法可采用高效液相色譜法(HPLC)、分光光度法和紙色譜法［8-13］。HPLC樣品需要量小、結(jié)果精確，但常常會(huì)受到儀器條件制約;紙色譜簡(jiǎn)便，適合于混合樣品的分離，但不能直接進(jìn)行定量分析;分光光度法快速、簡(jiǎn)單，但不適合于該類(lèi)混合樣品的測(cè)定。本文將紙色譜與分光光度法結(jié)合起來(lái)，建立了定量測(cè)定轉(zhuǎn)化體系中dAR的快速方法。

1 材料

dAR、dTR、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(Ade)，均為分析純生化試劑;氨水，冰醋酸，異丙醇，正丁醇，鹽酸等均為分析純。

752紫外光柵分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;BS110型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;ZF-8型三用紫外分析儀，上海康華生化儀器制造有限公司;Eppendorf Centrifuge 5804 R冷凍離心機(jī)。

2 方法與結(jié)果

2.1 紙色譜過(guò)程及其條件選擇

2.1.1 紙色譜方法 分別配制濃度為30 mmol/L的dAR、dTR、T、Ade溶液。將新華一號(hào)濾紙裁制成20 cm×20 cm規(guī)格備用。各取對(duì)照品溶液及混合溶液2.0μL點(diǎn)樣于新華一號(hào)濾紙，用不同成份的展開(kāi)劑展開(kāi)，取出濾紙40℃烘干后在254 nm波長(zhǎng)下觀察，畫(huà)出各個(gè)紫色斑點(diǎn)，測(cè)量遷移距離，計(jì)算遷移率(Rf)。

2.1.2 正丁醇-冰乙酸展開(kāi)劑系統(tǒng)分離dAR 首先以不同比例的正丁醇、冰乙酸、水作為展開(kāi)劑，將各對(duì)照品及混合對(duì)照品點(diǎn)樣后展開(kāi)，觀察各對(duì)照品展開(kāi)后的Rf值及斑點(diǎn)情況。結(jié)果表明混合對(duì)照品色譜后形成2個(gè)斑點(diǎn)，其中dAR和Ade總是在一個(gè)色譜斑點(diǎn)內(nèi)無(wú)法分開(kāi)，dTR和T在另一個(gè)色譜斑點(diǎn)無(wú)法分開(kāi)。說(shuō)明采用該展開(kāi)劑能將四種成分按嘌呤類(lèi)和嘧啶類(lèi)分開(kāi)，但堿基與帶有相應(yīng)堿基的脫氧核苷不能有效分開(kāi)。當(dāng)用正丁醇-冰乙酸-水(6∶1∶3)為展開(kāi)劑時(shí)，嘌呤類(lèi)與嘧啶類(lèi)成分的分離效果較好，此時(shí) dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分別為 0.77，0.84，0.77 和 0.84。

2.1.3 異丙醇-氨水展開(kāi)劑系統(tǒng)分離dAR 以不同比例的異丙醇、氨水、水為展開(kāi)劑，紙色譜后觀察各對(duì)照品展開(kāi)后的Rf值及斑點(diǎn)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ade很容易與其它三種成分分開(kāi)，但其它三種成分卻不能完全分開(kāi)。當(dāng)用異丙醇-氨水-水(7∶2∶1)展開(kāi)時(shí)，嘌呤類(lèi)與其它3種成分的分離效果最好，dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分別為0.83，0.85，0.65 和0.82。

2.1.4 雙向紙色譜分離dAR 在dAR生物合成反應(yīng)中，重點(diǎn)是將產(chǎn)物分離并進(jìn)行定量測(cè)定。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正丁醇-冰乙酸展開(kāi)劑可將dAR、Ade與dAR、T分開(kāi)，而采用異丙醇-氨水展開(kāi)劑可將Ade與其它成分分開(kāi)，如果進(jìn)行雙向紙色譜［11］，就可能將dAR與其它各成分分開(kāi)。因此實(shí)驗(yàn)首先用正丁醇-冰乙酸對(duì)混合樣品進(jìn)行分離，然后將濾紙烘干后在展開(kāi)劑異丙醇-氨水中進(jìn)行第二向色譜，結(jié)果dAR與其它三種成分得到了良好的分離。經(jīng)雙向紙色譜分離的dAR樣點(diǎn)可進(jìn)一步用分光光度法進(jìn)行定量測(cè)定。

2.1.5 正丁醇-異丙醇展開(kāi)劑系統(tǒng)分離dAR 雖然采用雙向紙色譜可以將dAR與其它三種成分分離，但由于要進(jìn)行二次色譜，所用時(shí)間就較長(zhǎng)，這不利于轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程對(duì)樣品的大量分析工作。如果根據(jù)上述兩種展開(kāi)劑的極性特點(diǎn)，調(diào)整展開(kāi)劑成分，則有可能采用一個(gè)展開(kāi)劑就可將dAR與其它三種成分分開(kāi)。我們將展開(kāi)劑中非極性部分調(diào)整為正丁醇與異丙醇，極性成分使用冰乙酸或氨水，考察其對(duì)四種成分的分離情況。

以正丁醇-異丙醇-冰乙酸為展開(kāi)劑，經(jīng)過(guò)不同的配比色譜試驗(yàn)，結(jié)果顯示該展開(kāi)劑對(duì)四種成分的分離效果均不理想(圖1A)，目標(biāo)產(chǎn)物與其它成分不能有效分離，其中正丁醇-異丙醇-冰乙酸-水(3∶3∶2∶2)為展開(kāi)劑時(shí)，dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分別為0.83，0.87，0.83 和 0.87。以正丁醇-異丙醇-氨水為展開(kāi)劑對(duì)混合樣品進(jìn)行紙色譜，四種樣品混合樣經(jīng)過(guò)色譜出現(xiàn)三個(gè)色譜斑點(diǎn)(圖1B)，其中dAR單獨(dú)為一個(gè)斑點(diǎn)，Rf值最大，位置在最前方;dTR和T在一個(gè)斑色譜點(diǎn)中，二者不能完全分開(kāi);Ade單獨(dú)成一個(gè)斑點(diǎn)，Rf值最小，位置在最后面。雖然在此系統(tǒng)中dAR與T仍不能有效分開(kāi)，但是作為目的產(chǎn)物的dTR或作為底物之一的Ade都得到了良好的分離效果，因此可對(duì)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行定性鑒定，也可為為產(chǎn)物濃度或底物濃度變化進(jìn)行定量分析奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)表明，正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)為展開(kāi)劑時(shí)的分離效果最好，此時(shí)dAR、dTR、Ade和 T 的 Rf值分別為 0.80，0.72，0.62 和 0.72，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用此比例的展開(kāi)劑對(duì)轉(zhuǎn)化體系中的dAR進(jìn)行紙色譜分離。

圖1 正丁醇-異丙醇-冰醋酸、正丁醇-異丙醇-氨水紙色譜對(duì)4種化合物的分離結(jié)果Fig.1 The separated result of four compounds obtained by the paper chromatography method with chromatographic solution nbutanol-isopropyl alcohol-glacial acetic acid and n-butanol-isopropyl alcohol-ammonia

2.2 紙色譜-分光光度法方法學(xué)試驗(yàn)

2.2.1 dAR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將10～60 mmol/L dAR對(duì)照品溶液各2.0μL點(diǎn)樣于新華一號(hào)濾紙，用正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)展開(kāi)。待展開(kāi)劑上行至距濾紙頂端2.0 cm左右時(shí)，取出，40℃烘干后，在254 nm波長(zhǎng)下觀察，畫(huà)出紫色斑點(diǎn)，剪下斑點(diǎn)于5 mL離心管中，加水3 mL浸泡一定時(shí)間，在258 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，繪制dAR標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性擬合，得到的線性回歸方程為:C=101.01 A －3.72，r=0.999 7。

2.2.2 紙色譜-分光光度測(cè)定dAR含量的重復(fù)性試驗(yàn) 將含有30 mmol/L dAR的四種對(duì)照品混合液定量點(diǎn)樣后，以展開(kāi)劑正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)進(jìn)行紙色譜，將色譜的dAR樣品點(diǎn)剪下，水浸泡后測(cè)定258 nm波長(zhǎng)處的A值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算dAR濃度。5次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的RSD為0.34%。

2.3 紙色譜-分光光度測(cè)定轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中dAR含量

2.3.1 菌種培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化反應(yīng) 本試驗(yàn)篩選的轉(zhuǎn)化合成dAR菌株，試管斜面保存。斜面培養(yǎng)基為酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，水 1 000 mL，瓊脂2.0%，pH 7.0 ～7.5。產(chǎn)酶培養(yǎng)基為牛肉膏10 g，酵母膏15 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.0。

在500 mL錐形瓶加入產(chǎn)酶培養(yǎng)基120 mL，滅菌，從斜面上挑取菌體一環(huán)，37℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)20 h，4℃，5 000 r/min離心10 min，得菌體，－20℃下冷凍備用。

在磷酸鹽緩沖液中添加dTR、Ade和轉(zhuǎn)化用的菌體細(xì)胞，攪拌反應(yīng)5 h后取樣分析。

2.3.2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中dAR分光光度測(cè)定 在測(cè)定轉(zhuǎn)化體系中dAR時(shí)，需將轉(zhuǎn)化體系取1 mL，4℃，10 000 r/min 離心1 min，取上清液，點(diǎn)樣2.0 μL，并點(diǎn)樣四種對(duì)照品混合溶液，展開(kāi)后，烘干、畫(huà)出與dAR對(duì)照品斑點(diǎn)位置一致的紫色斑點(diǎn)，剪下，用水3 mL浸泡120 min，測(cè)定A值，根據(jù)dAR標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其含量。表1為一次溫度條件轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，轉(zhuǎn)化率以Ade為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。

表1 紙色譜-分光光度法測(cè)定轉(zhuǎn)化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The deoxyadenosine content in biotransformation system measured by paper chromatography-spectrophotometry method

2.3.3 轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中dAR回收率測(cè)定 取dAR轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化液，4℃，10 000 r/min離心1 min，取上清液，用HPLC法精確測(cè)定dAR含量［14］，然后精確稀釋至20 mmol/L的濃度。用紙色譜-分光光度法測(cè)定dAR含量。紙色譜點(diǎn)樣時(shí)分別點(diǎn)5個(gè)樣點(diǎn)，點(diǎn)樣量為2.0μL，待樣點(diǎn)干后再分別覆蓋點(diǎn)樣0，10，20，30，40 mmol/L dAR 對(duì)照品各 2.0 μL，然后用正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)進(jìn)行色譜分離、分光光度測(cè)定，計(jì)算dAR濃度及其回收率(表2)。平均回收率為99.4%，RSD為0.99%。表明采用展開(kāi)劑正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)分離轉(zhuǎn)化液各成分，dAR得到良好分離，與對(duì)照品混合物色譜分離效果相同;分光光測(cè)定轉(zhuǎn)化液中dAR的濃度與HPLC法一致，試驗(yàn)重復(fù)性良好，回收率可達(dá)99%以上。

表2 轉(zhuǎn)化液中dAR含量測(cè)定及回收率試驗(yàn)Tab.2 The measuring results of deoxyadenosine content and recovery in biotransformation system

3 討論

用正丁醇-冰乙酸-水(6∶1∶3)、異丙醇-氨水-水(7∶2∶1)分別作為單向紙色譜的展開(kāi)劑，均不能實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)物dAR與其它成分分開(kāi)，但先后用兩種展開(kāi)劑進(jìn)行雙向紙色譜可將dAR與其它堿基和核苷成分有效分離開(kāi)，以此為基礎(chǔ)結(jié)合紫外分光光度法即可實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程dAR產(chǎn)物的定量。該測(cè)定方法雖然簡(jiǎn)單，但一個(gè)樣品要進(jìn)行2次紙色譜，所用時(shí)間增加了一倍，這顯然對(duì)于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的分析測(cè)定不利。為了簡(jiǎn)化雙向色譜為一次色譜，調(diào)整上述兩種展開(kāi)劑的極性與非極性成分及比例，結(jié)果其中以正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)為展開(kāi)劑，可以一次色譜將dAR、Ade分別與其它成分分離，進(jìn)一步用分光光度法測(cè)定分離的dAR量，即可計(jì)算出轉(zhuǎn)化體系中的dAR濃度。該測(cè)定結(jié)果可靠，與HPLC法一致，且重復(fù)性好，回收率高，更重要的是時(shí)間測(cè)定縮短了一半。在沒(méi)有高效液相色譜儀的條件下，該方法是一種操作簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確性好、成本較低的快速定性和定量的分析方法。此外，與HPLC相比，該方法的優(yōu)點(diǎn)是可在一張濾紙上分離10～20個(gè)樣品，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)紙色譜分離，由于分光光度測(cè)定用時(shí)很少，因此紙色譜-分光光度法每測(cè)定一個(gè)樣品的時(shí)間實(shí)際比HPLC法短。紙色譜-分光光度測(cè)定dAR方法的建立，可以滿足dAR轉(zhuǎn)化條件實(shí)驗(yàn)、菌種篩選、產(chǎn)品檢測(cè)等大量定量測(cè)定工作的需要，對(duì)dAR的研究與開(kāi)發(fā)具有重要意義。

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Determination of deoxyadenosine in biotransformation system by paper chromatography-spectrophotometry

LIU Guo-sheng1，WANG Jian-kun1，XING Shan-tao2，WANG Hai-lei1，CHEN Lin1，WANG Yu-juan1
(1.School of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China;2.Xinxiang Tuoxin Biochemical Technology ＆ Science Co.，Ltd.，Xinxiang 453000，China)

Purpose To establish a paper chromatography-spectrophotometry method for the determination of deoxyadenosine content quickly and easily in biotransrormation system.Methods The deoxyadenosine product was separated from mixture by means of the paper chromatography method with different polarity chromatographic solutions，and the concentration of separated deoxyadenosine was measured with spectrophotometer.Results The separation effect of 4 kinds chromatographic solutions were tested.The separation of deoxyadenosine could be achieved effectively，when solution n-butanol-isopropyl alcohol-ammonia solution-water(3∶3∶2∶2)was used as solvent to do single-dimensional paper chromatography.The separated deoxyadenosine was re-dissolved，and its absorption value was measured at 258 nm.The concentration of deoxyadenosine in biotransformation liquid could be calculated according to th e absorption valueand standard curve.Conclusion The determining results by of paper chromatography-spectrophotometry method was the same as that by HPLC method.This method was simple and effective with a good reproducibility for the determination of deoxyadenosine product in biotransrormation system.

deoxyadenosine;biotransformation;paper chromatography;chromatographic solution;spectrophotometry

TQ460.7;R927.2

A

1005-1678(2012)02-0132-04

2010-12-06

國(guó)家科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動(dòng)項(xiàng)目(2009GJD00044);河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2008A180018)

劉國(guó)生，男，博士，教授，從事工業(yè)微生物研究，E-mail:hnliugs@163.com。