張俊瑞，馬夏吟，張紅星，郝彥玲

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，北京 102206）

牛凝乳酶原基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)及活性檢測(cè)

張俊瑞1，馬夏吟1，張紅星2，郝彥玲1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，北京 102206）

以實(shí)驗(yàn)室保存的攜帶凝乳酶原前體基因的重組載體pMD 19-T/bPPC為模板克隆凝乳酶原基因，經(jīng)雙酶切后與載體pET-30a連接得到重組載體pET-30a/bPC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，采用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。重組蛋白經(jīng)變性/復(fù)性、DEAE-Sepharose Fast Flow純化和自催化后檢測(cè)凝乳活性。結(jié)果表明，重組凝乳酶原基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的68%，采用Arima K方法檢測(cè)，其凝乳活力達(dá)到80 SU/mL。因此，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大量制備具有生物活性的重組牛凝乳酶原的策略是可行的，研究結(jié)果為彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)天然牛凝乳酶的短缺提供一種途徑。

牛凝乳酶原；高效表達(dá)；大腸桿菌BL21（DE3）；凝乳活性

0 引言

小牛凝乳酶是從未斷奶的小牛皺胃中提取的一種可以專(zhuān)一性裂解κ-酪蛋白中Phe105-Met106肽鍵的酸性天冬氨酸蛋白酶，是干酪生產(chǎn)過(guò)程中不可缺少的酶制劑[1-4]。然而隨著全球性小牛資源的短缺，牛凝乳酶來(lái)源的不足成為干酪行業(yè)發(fā)展的瓶頸。

至今，F(xiàn)DA（美國(guó)食品和藥物管理局）已批準(zhǔn)了3種凝乳酶生物工程產(chǎn)品可用于干酪生產(chǎn)，即Gist Brocades公司（荷蘭）的乳酸克魯維酵母菌凝乳酶，Genencor公司（美國(guó)）的黑曲霉菌凝乳酶和Pfizer公司（美國(guó)）的大腸桿菌K-12凝乳酶。而我國(guó)對(duì)基因工程凝乳酶的研究卻一直處于探索階段，始終未能實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，導(dǎo)致我國(guó)凝乳酶主要依賴(lài)于進(jìn)口，嚴(yán)重制約我國(guó)干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7-8]。本研究結(jié)果旨在為構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的工程菌株生產(chǎn)凝乳酶提供有效途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

質(zhì)粒和菌株：攜帶牛凝乳酶原前體基因的重組載體pMD 19-T/bPPC由本實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)載體pET-30a；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）。

試劑及儀器：限制性?xún)?nèi)切酶，Ex Taq DNA聚合酶及T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa，DEAE Sepharose Fast Flow，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體pET-30a/bPC的構(gòu)建

以含有牛凝乳酶原前體基因的pMD 19-T/bPPC為模板，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的牛凝乳酶原基因序列（Accession NM_180994）設(shè)計(jì)引物：

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因bPC，經(jīng)NdeⅠ和NotⅠ雙酶切后與載體pET-30a(+)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序后，重組子命名為pET-30 a/bPC。

1.2.2 重組牛凝乳酶原的誘導(dǎo)表達(dá)

重組載體pET-30a/bPC轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21（DE3）后，以1%的比例接種于LB/Kan液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)0.4-0.6，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，收集菌體，超聲破碎，利用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 包涵體的變性/復(fù)性

重組牛凝乳酶原在大腸桿菌中以包涵體的形式積累，經(jīng)收集后溶于含有8 M尿素的Buffer A（濃度為50 mmol/L的KH2PO4，1 mmol/L的EDTA，50 mmol/L的NaCl，pH值為11.0）進(jìn)行變性，取上清25倍稀釋于含有GSH/GSSG的Buffer A中，室溫放置24 h后，用HCl將pH值調(diào)至8.0，并于室溫下放置1 h，于緩沖液（濃度為20 mmol/L的Tris-Cl（pH=8.0），50 mmol/L的NaCl，1 mmol/L的EDTA）中進(jìn)行4℃過(guò)夜透析，即得到復(fù)性后的凝乳酶原[9]。

1.2.4 重組牛凝乳酶原的純化及活性檢測(cè)

利用DEAE Sepharose Fast Flow純化復(fù)性后的凝乳酶原，經(jīng)平衡緩沖液（20 mmol/L的Tris-Cl（pH=8.0），1 mmol/L的EDTA，50 mmol/L的NaCl）平衡填料，透析后的凝乳酶原經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，以2 mL/min的流速上樣。用不同濃度NaCl的Tris-HCl緩沖液線性洗脫目的蛋白，NaCl濃度范圍為0.1～0.5 mol/L，流速為2 mL/min。在線監(jiān)測(cè)280 nm的吸收值，收集到的洗脫液經(jīng)酸化/中和后，采用Arima K的方法檢測(cè)凝乳活性[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體pET-30a/bPC的構(gòu)建

對(duì)重組子進(jìn)行NdeⅠ和NotⅠ的雙酶切鑒定，由圖1可以看出，獲得的兩個(gè)片段與預(yù)期大小5.4 kbp和1.1 kbp相一致，經(jīng)上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，其結(jié)果與GenBank上發(fā)表的序列（Accession NM_180994）同源性達(dá)100%。表明重組表達(dá)載體pET-30a/bPC構(gòu)建成功。

2.2 重組牛凝乳酶原的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，重組牛凝乳酶原主要存在于菌體裂解液的沉淀中，表明目的蛋白以包涵體的形式積累。由圖2可知，其分子量約41 ku，與理論值相符。經(jīng)凝膠定量軟件Quality One分析，重組牛凝乳酶原占菌體總蛋白量的68%。

圖1中，M為DL15000；1為質(zhì)粒pET-30a(+)雙酶切/NdeⅠ+ NotⅠ；2為重組質(zhì)粒pET-30a/bPC雙酶切/NdeⅠ+NotⅠ；3為目的基因bPC。

圖2中，M為低分子量蛋白Marker；1為含有空載質(zhì)粒pET-30a的菌體裂解液上清；2為含有重組質(zhì)粒pET-30a/bPC的菌體裂解液上清；3為含有空載質(zhì)粒pET-30a的菌體裂解液沉淀；4為含有重組質(zhì)粒pET-30a/bPC的菌體裂解液沉淀。

2.3 包涵體的復(fù)性及純化

包涵體在高濃度變性劑及強(qiáng)堿性條件下呈變性可溶狀態(tài)，經(jīng)25倍稀釋去除變性劑后，在GSH/GSSG的輔助下逐漸折疊復(fù)性，再經(jīng)透析即得到復(fù)性后可溶的凝乳酶原。采用DEAE-Sepharose Fast Flow純化凝乳酶原，在0.3 M NaCl濃度時(shí)有最大吸收峰，收集濃縮后，采用SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)合Quality One軟件分析，其純度達(dá)到99%（見(jiàn)圖3）。

圖3中M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為誘導(dǎo)后菌體裂解沉淀；2為離子交換層析純化后的凝乳酶原溶液。

2.4 重組牛凝乳酶原的活化及凝乳酶的活性檢測(cè)

純化后的凝乳酶原經(jīng)酸化/中和后，采用Arima K方法進(jìn)行檢測(cè)。從圖4可知：當(dāng)脫脂乳中加入重組牛凝乳酶，脫脂乳迅速凝乳，而添加不含重組牛凝乳酶的緩沖液做對(duì)照時(shí)，脂乳未出現(xiàn)凝乳現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：重組牛凝乳酶具有生物活性，其活性可達(dá)80 SU/mL。

圖4中，1為以加入不含重組牛凝乳酶的緩沖液為陰性對(duì)照組；2為加入重組牛凝乳酶溶液后的效果。

3 結(jié)果與討論

本研究中，重組牛凝乳酶原在大腸桿菌中以包涵體的形式積累，占菌體總蛋白的68%，而經(jīng)變性/復(fù)性、純化及自催化后，獲得的具有凝乳活性的重組凝乳酶僅21%。在整個(gè)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)自催化時(shí)，當(dāng)pH值回調(diào)至6.3后出現(xiàn)大量沉淀是造成活性重組凝乳酶得率低的主要原因。分析可能上由于在體外復(fù)性過(guò)程中僅部分凝乳酶原能完成正確折疊進(jìn)而實(shí)現(xiàn)自催化。而未正確折疊的重組蛋白，則在酸化/中和的過(guò)程中以沉淀形式析出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與1983年J.S.Emtage等人的報(bào)道相一致。

為提高包涵體的復(fù)性率，2002年，Huge G.Menzella等人在控制蛋白質(zhì)量濃度為0.8 g/L的條件下，采用空氣氧化（Air Oxidation）的方法可以使48%的變性蛋白正確折疊[11]。而為了得到可溶性凝乳酶原，中國(guó)中科院微生物所的楊開(kāi)宇等人經(jīng)研究表明，PRPA（protein disulfide isomerase-related protein A）與凝乳酶原在大腸桿菌中的共表達(dá)，可以使部分凝乳酶原以可溶形式表達(dá)[12]。而M.M.Harmsen等人將BiP（Binding Protein,在酵母中是一種由KAR2基因編碼的約78 ku的多肽分子，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，與蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和折疊有關(guān)）與牛凝乳酶原在釀酒酵母中共表達(dá)，可以使凝乳酶原的胞外表達(dá)量提高20倍左右[13]。因而通過(guò)各種方法提高包涵體的復(fù)性率或者使目的蛋白以可溶形式表達(dá)將是今后繼續(xù)努力的方向。

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High-efficiency expression and activity analysis of bovine prochymosin in Escherichia coli

ZHANG Jun-rui1,MA Xia-yin1,ZHANG Hong-xing2,HAO Yan-ling1
(1.College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China；2.College of Food Science,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

The bovine prochymosin gene was cloned from the recombinant vector of pMD 19-T/bPPC harboring the interest gene,and which was then ligated with the expression vector pET-30a.Ligated products were transformed intoE.coliBL21(DE3).Recombinant protein was analysed by SDS-PAGE after the IPTG induction.The recombinant bovine chymosin was then used to assay the milk-clotting activity after denaturation/renaturation,DEAE-Sepharose Fast Flow purification and activation.The recombinant prochymosin was high-efficiently expressed inE.coli,making up 68%of the total protein.The milk-clotting activity of recombinant chymosin was 80 SU/mL using the Arima K method.So it is possible to largely produce bioactive recombinant bovine prochymosin through theE.coliexpression system.These results would provide a method to solve the problem of lack of authentic bovine chymosin.

bovine prochymosin；high-efficiency expression；E.coliBL21(DE3)；milk-clotting activity

Q93-33

A

1001-2230（2012）03-0004-03

2011-11-07

張俊瑞（1987-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锓肿由飳W(xué)。

郝彥玲