邵景海，楊郁葒，李亮，韓迪，趙霞，方曙光

（1.完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，哈爾濱 150000；2.潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 710021）

一株羅伊氏乳桿菌的生物學(xué)特性研究

邵景海1，楊郁葒1，李亮2，韓迪2，趙霞2，方曙光2

（1.完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，哈爾濱 150000；2.潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 710021）

研究了一株完達(dá)山乳業(yè)和潤盈生物菌種研究項目組分離的羅伊氏乳桿菌LR-G100的耐胃酸、耐膽鹽、降膽固醇和抑制腸道有害菌的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌在pH值為2.5～4.5條件下，具有較強(qiáng)的生存能力；在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.5%環(huán)境中，活菌數(shù)能保持在106mL-1以上；在反應(yīng)16 h后，同化膽固醇百分率能達(dá)到50%以上；對腸道有害菌的抑制效果也非常顯著。

羅伊氏乳桿菌；生物學(xué)特性；降膽固醇；抑菌

0 引言

羅伊氏乳桿菌是益生菌中具有代表性的典型菌屬，具有降膽固醇，改善和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高機(jī)體免疫力的功能[1]。本實驗菌株羅伊氏乳桿菌LRG100，完達(dá)山乳業(yè)和潤盈生物菌種研究項目組分離篩選自高加索自然發(fā)酵的酸奶中。研究表明，益生菌能發(fā)揮保健功能，前提條件之一，是到達(dá)人體腸道的活菌數(shù)應(yīng)在106cfu/mL以上[2]。人體胃腸為高酸、高膽鹽環(huán)境，羅伊氏乳桿菌進(jìn)入人體后，能否順利通過胃腸道環(huán)境，是決定其發(fā)揮保健功能的關(guān)鍵因素所在。本實驗研究了羅伊氏乳桿菌LR-G100的生長特性，對胃酸、膽鹽的耐受性，降膽固醇特性以及抑菌特性，以期為羅伊氏乳桿菌的益生作用提供理論依據(jù)，進(jìn)而為其保健功能的的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：羅伊氏乳桿菌（編號為LR-G100），此菌株分離于長壽地區(qū)高加索山脈的酸奶，菌株編號為LR-G100，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為羅伊氏乳桿菌。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，Skirrow氏培養(yǎng)基等，121℃滅菌20 min。

主要儀器：DHP-9082型培養(yǎng)箱，WFZ UV-2102型紫外可見分光光度計，LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，蘇州佳寶JB-VS-1300U型潔凈工作臺等。

1.2 方法

（1）菌株鑒定。經(jīng)過生理生化初步確定后，再經(jīng)過16s RNA提取擴(kuò)增測序，并在NCBI比對，做菌種鑒定。

（2）產(chǎn)酸和生長動力學(xué)。將LR-G100活化18 h后，采用2%接種量，接種于12%全脂奶粉復(fù)原乳中，37℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第0～18 h內(nèi)，每隔1 h取樣，測酸度及活菌數(shù)。采用0.l mol/L的氫氧化鈉溶液滴定酸度(oT)，活菌計數(shù)采用傾注平板計數(shù)法[3]。

（3）耐酸測試。用濃度為0.1 mol/L的HCl將MRS液體培養(yǎng)基pH值，分別調(diào)為1.5，2.5，3.5，4.5；115℃滅菌15 min，冷卻，無菌條件下接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的LR-G100種子液，于37℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)的0～6 h內(nèi)每隔1 h取樣計活菌數(shù)。

（4）耐膽鹽實驗。用豬膽汁鹽將MRS液體培養(yǎng)基的膽汁鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別調(diào)為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%；115℃滅菌15 min，冷卻，無菌條件下接種2%的LRG100種子液，于37℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)的0～5 h內(nèi)每隔1 h取樣計活菌數(shù)。

（5）同化膽固醇能力測定。采用比色法來測定LR-G100對膽固醇的同化效果[4]。

（6）抑制胃腸致病菌測定。采用單層瓊脂擴(kuò)散法[5]，測定LR-G100對大腸桿菌和幽門螺旋桿菌的抑菌效果，以抑菌圈直徑作為抑菌效果的指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌16sRNA鑒定

經(jīng)過16sRNA提取擴(kuò)增測序，并在NCBI做序列比對后，鑒定為羅伊氏乳桿菌，具體序列如下：

2.2 產(chǎn)酸和生長動力學(xué)測定

在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%全脂奶粉復(fù)原乳中，接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的LR-G100種子液，于37℃恒溫培養(yǎng)，其產(chǎn)酸和活菌數(shù)變化如圖1和圖2所示。由圖2和圖3可以看出，發(fā)酵10 h時，發(fā)酵復(fù)原乳酸度達(dá)到67oT，活菌數(shù)維持在3.1×108mL-1的水平。

2.3 耐酸性能測定

LR-G100在不同pH值的滅菌MRS液體培養(yǎng)基中,活菌數(shù)變化如表1所示。由表1可以看出，在pH值為4.5條件下，LR-G100活菌數(shù)呈現(xiàn)增加趨勢，即使在pH值為2.5條件下，4 h的活菌數(shù)仍達(dá)到106mL-1，而在pH值為1.5以下，經(jīng)過4 h培養(yǎng)后大部分羅伊氏乳桿菌死亡，但在培養(yǎng)2 h后的活菌數(shù)仍能達(dá)到105mL-1，表明LR-G100耐酸性極優(yōu)，可通過胃的強(qiáng)酸環(huán)境。

表1 LR-G100在不同pH值條件下的活菌數(shù)變化狀況

2.4 耐膽鹽性能測定

LR-G100在不同膽鹽濃度的滅菌MRS液體培養(yǎng)基中,活菌數(shù)變化如圖3所示，雖然在0.4%膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h時LR-G100活菌數(shù)有所下降，但6 h后仍能維持在106mL-1以上，這表明LR-G100在0.1%～0.4%膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下耐受性極優(yōu)。也說明LR-G100能夠通過小腸到達(dá)大腸，可以充分發(fā)揮其益生作用。

2.5 同化膽固醇能力測定

通過測定羅伊氏乳桿菌發(fā)酵乳中,膽固醇的吸光度的變化，可以確定LR-G100對膽固醇的同化效果，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，LR-G100在16 h對膽固醇的同化率達(dá)到50%以上，且同化率隨著時間延長呈上升趨勢，這說明LR-G100有較好的同化膽固醇的能力。

表2 LR-G100同化膽固醇的能力

2.6 對胃腸致病菌的抑制作用測定

平板抑菌實驗顯示，LR-G100對大腸桿菌的抑菌圈直徑都在11 mm以上，平均在11.5 mm(見圖4)，大于一般乳酸菌對大腸桿菌的抑制圈直徑（7～10 mm）；LR-G100對幽門螺旋桿菌的抑菌圈直徑在10 mm以上，平均在11.5 mm(見圖5)，大于一般的乳酸菌對幽門螺旋桿菌的抑制圈直徑（5～7 mm），此結(jié)果表明，LRG100能有效地抑制或殺死大腸桿菌和幽門螺旋桿菌。

3 結(jié)論

綜上所述，從俄羅斯高加索地區(qū)自然發(fā)酵酸奶樣中，分離和鑒定出的一株羅伊氏乳桿菌LR-G100，具有優(yōu)良的益生菌生物學(xué)特性，在模擬胃腸環(huán)境條件下，具有較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽能力，絕大多數(shù)能通過腸胃到達(dá)腸道，降解膽固醇效果明顯，并能抑制有害菌，起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，可適合添加于功能型益生菌酸奶或發(fā)酵乳飲品中。在瑞士和日本，羅伊氏乳桿菌已經(jīng)在許多功能性食品中得到應(yīng)用。隨著國內(nèi)對羅伊氏乳桿菌研究的不斷深入，該菌在乳制品行業(yè)，以及食品行業(yè)的應(yīng)用領(lǐng)域和使用方法也會不斷擴(kuò)大，這也是我國益生菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢和必然結(jié)果。

[1]龐潔,周娜,劉鵬,等.羅伊氏乳桿菌的益生功能[J].中國生物工程雜志,2011,31(5):131-137.

[2]GISMONDO M R,DRAGO L,LOMBARDY A.Review of Probiotics Available to Modify Gastrointestinal Flora[J].International Journal of Antimicrobial Agents,1999,12:287-292.

[3]楊潔彬,興華,代文.乳酸菌—生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1991:1-3.

[4]趙瑞香,孫俊良,李明靜,等.嗜酸乳桿菌同化MRS培養(yǎng)基中膽固醇能力的研究[J].Chinese Journal of Micro ecology,2005,17(8):254-255.

[5]李正華.羅伊氏乳桿菌生物學(xué)特性及功能性發(fā)酵乳的研究[D].無錫:江南大學(xué),2003.

Phenotype investigation on a strain of lactobacillus reuteri

SHAO Jing-hai1，YANG Yu-hong1，LI Liang2，HAN Di2，ZHAO Xiao2，F(xiàn)ANG Shu-guang2
（1.Wondersun Dairy Company,Harbin 150000，China；2.BioGrowing Co.Ltd.,Shanghai 710021，China）

The phenotype characteristics:survivability to gastric acid and bile salt,capacity of cholesterol assimilation,and anti-microbial effect to pathogenic bacteria,of a strain ofLactobacillus reuteriLR-G100,were investigated.The result shows that this strain has strong survivability under pH 2.5～4.5,and the vial cell number maintains above 106cfu/mL even when bile salt concentration is 0.1%～0.5%.This strain has distinct anti-microbial effect to enteropathogenic bacteria,and the capacity(%)of cholesterol assimilation could reach 50%after 16 hrs of reaction.

Lactobacillus reuteri；phenotype characteristics；cholesterol assimilation；anti-microbial

Q936

A

1001-2230（2012）03-0028-03

2012-01-20

邵景海（1975-），男，食品高級工程師，研究方向為乳制品加工。