金雪花，呂淑霞，張超，徐彬，于曉丹

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110866)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一種常見腸道致病菌，其污染會(huì)給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失，還會(huì)引起人類腹瀉等腸道疾病及食物中毒，出現(xiàn)腹瀉、腹部痙攣、惡心、嘔吐和頭痛等癥狀［1］。自2001年以來，副溶血弧菌性食物中毒爆發(fā)已經(jīng)成為中國最常見的食源性疾患。隨著人們對(duì)食品安全性要求的不斷提高，對(duì)細(xì)菌的“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”(Viable but non-culturable state，VBNC)進(jìn)行檢測(cè)研究的實(shí)際意義越來越明顯。常規(guī)的基于分子水平檢測(cè)病原菌的方法以其具有快捷、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已用于副溶血性弧菌及其他致病菌的檢測(cè)研究［2］，但是其缺點(diǎn)在于不能區(qū)分所檢測(cè)到的病原菌是活細(xì)胞還是死細(xì)胞，而且由于需要精密度高的儀器而限制了其在現(xiàn)場(chǎng)和基層單位的應(yīng)用［3］。近年來環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)以其高效、靈敏、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，使其在食源性致病菌以及病毒的檢測(cè)中得到了重要的應(yīng)用［4-6］。LAMP檢測(cè)法無需精密度高的儀器，僅需在恒溫條件下便可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)［7］，是一種可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)和基層單位應(yīng)用的方法。Thidium Bromide Monoazide(EMA)作為一種DNA結(jié)合染料，易光解形成氮賓化合物且能滲透到細(xì)胞壁(膜)不完整的菌體內(nèi)，與DNA分子不可逆的共價(jià)結(jié)合，從而抑制死細(xì)胞的DNA擴(kuò)增。因此，EMA與PCR、LAMP結(jié)合檢測(cè)鑒定副溶血性弧菌的死/活細(xì)胞具有一定的可行性。目前，已有EMA與PCR、LAMP相結(jié)合，成功抑制死細(xì)胞的擴(kuò)增且對(duì)混合菌中活細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)的報(bào)道［8-10］。本試驗(yàn)將具有選擇滲透性的EMA與高效、靈敏的LAMP相結(jié)合，在純培養(yǎng)條件下，對(duì)副溶血性弧菌的死/活菌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)及鑒別，從而建立了EMA-LAMP檢測(cè)法，并將此方法與EMAPCR法進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，ATCC 17802)購自北京中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要試劑LAMP體系有關(guān)試劑:Bst DNA聚合酶(8 U/μL)、1×ThermoPol buffer Biolabs;Betaine Fluka;MgSO4;PCR體系有關(guān)試劑:Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、dNTPs、10×Buffer(含1.5 mmol/L Mg2+)、LoadingBuffer TAKARA公司;DL1000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker上海生物工程有限公司;5×TBE電泳緩沖液:稱取Tris 54.0 g、硼酸27.5 g，并加入0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)20.0 mL，定容至1 000 mL。用時(shí)稀釋到1.0×TBE電泳緩沖液(pH 8.3);EB母液:將EB配制成10.0 mg/mL，用鋁箔或黑紙包后貯于室溫，使用前稀釋;EMA母液:無菌水溶解EMA，配制成1.0 mg/mL母液，用錫箔紙包裹置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;PCR儀，TECHNE公司;JY600C型電泳儀，北京君意東方電用儀器有限公司;凝膠成像系統(tǒng)，伯樂公司;移液槍，Eppendorf;500W鹵鎢燈，沈陽藝沈器化玻站。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的副溶血性弧菌tlh基因序列(Accession number:AY 289609)中的保守序列，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件(Primer Explorer V4)在線進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)1套引物，包括2條外引物F3、B3，2條內(nèi)引物FIP、BIP和2條環(huán)引物L(fēng)F、LB。為了更有好地進(jìn)行EMA-PCR與EMA-LAMP法檢測(cè)副溶血性弧菌的優(yōu)劣對(duì)比，本文用LAMP反應(yīng)中的1對(duì)外引物F3、B3分別作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的上游引物和下游引物參與反應(yīng)，PCR擴(kuò)增片段為231 bp。以上引物由TAKARA公司合成。引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增tlh基因的LAMP引物序列Table 1 Sequences of LAMP primers for specific amplification of the tlh gene(Accession number:AY289609)

1.2.2 DNA模板制備TZ法［11］:取0.5 mL對(duì)數(shù)期菌懸液與等體積的2×TZ的細(xì)胞裂解液混勻，沸水浴10 min后冷卻到室溫，10 000 r/min離心5 min去掉沉淀，取上清液備用;TZ裂解液配置:2.0%Triton X-100，2.5 mg/mL的疊氮化鈉，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0。

1.2.3 熱處理殺死副溶血性弧菌取10.0 mL 37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的副溶血性弧菌菌懸液，用無菌的胰胨肉湯稀釋，使菌濃度為1.0×108cfu/mL。取以上處理的0.5 mL菌懸液于1.5 mL離心管中，參考祝儒剛等［1］的研究，直接將菌懸液在95℃水浴處理10 min，待菌懸液冷卻至室溫，涂平板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察計(jì)數(shù)。

1.2.4 不同濃度EMA對(duì)死菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增的影響取0.5 mL濃度為1.0×108cfu/mL的熱致死的副溶血性弧菌菌懸液，加入濃度為0.1 μg/μL的EMA試驗(yàn)用液，使EMA終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，混勻并于黑暗下室溫放置5 min后放在冰浴上，每5 min補(bǔ)充1次碎冰塊，距500 W鹵鎢燈16 cm，根據(jù)文獻(xiàn)［12］暫定曝光時(shí)間為30 min。然后10 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.5 mL生理鹽水，再10 000 r/min離心10 min，棄上清后加入0.5 mL無菌水。按照1.2.2中的方法抽提DNA進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

1.2.5 不同濃度EMA對(duì)活菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增的影響取0.5 mL濃度為1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌活細(xì)胞菌懸液，加入濃度為0.1 μg/μL的EMA試驗(yàn)用液，使EMA終濃度分別為0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 μg/mL，混勻并于黑暗下室溫放置5 min，進(jìn)行光照及光照后處理，同上。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

1.2.6 EMA最佳曝光時(shí)間的確定取0.5 mL熱致死的副溶血性弧菌菌懸液(濃度為1.0×108cfu/mL)加入8個(gè)1.5 mL離心管中，每管加入濃度為0.1 μg/μL的EMA試驗(yàn)用液，使其終濃度為上述優(yōu)化好的最小抑制死細(xì)胞擴(kuò)增的濃度，混勻并于黑暗下室溫放置5 min，然后將離心管開蓋放置冰上，距離500 W鹵鎢燈燈管16 cm，分別進(jìn)行0、1、5、10、15、20、25、和30 min的光照，每5 min補(bǔ)充1次冰，防止溫度升高。光照后處理同上。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增檢測(cè)。同樣方法取活菌菌懸液進(jìn)行EMA-LAMP和EMA-PCR作為對(duì)照。

1.2.7 EMA-LAMP和EMA-PCR擴(kuò)增混合菌中活菌細(xì)胞DNA的比較試驗(yàn)分3組進(jìn)行對(duì)照分析。A組為0.25 mL熱殺死細(xì)胞菌懸液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL經(jīng)無菌胰胨肉湯10倍比例稀釋的活細(xì)胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)中，進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增。陽性對(duì)照為0.5 mL含有1.0×108cfu/mL的活細(xì)胞菌懸液;B組為0.25 mL經(jīng)無菌胰胨肉湯進(jìn)行10倍比例稀釋的活細(xì)胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)分別混合于0.25 mL無菌水，進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增。陽性對(duì)照同上;C組為0.25 mL活細(xì)胞菌懸液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL經(jīng)無菌胰胨肉湯10倍比例稀釋的不同濃度(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的熱殺死菌細(xì)胞懸液中。進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增。陽性對(duì)照同上。以上3組分別加入EMA溶液，使其終濃度為最小抑制死細(xì)胞擴(kuò)增的濃度，黑暗下室溫放置5 min后，進(jìn)行光照及光照后處理。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

1.2.8 LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件MgSO42 mmol/L，dNTPs 1.0 mmol/L，betaine 1.0 mol/L，內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，環(huán)引物(LF和LB)各0.8 μmol/L，Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μL)0.8 μL，1×ThermoPol Reaction buffer 2.5 μL，DNA模板1 μL，補(bǔ)水至反應(yīng)體系25 μL;混勻，于63℃溫育30 min，80℃滅活10 min，冰浴2 min。

1.2.9 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件配制PCR反應(yīng)體系:dNTPs 0.8 mmol/L，引物各0.8 μmol/L，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，10×buffer(含Mg2+)2.5 μL，DNA模板2.0 μL，補(bǔ)水至反應(yīng)體系25.0 μL。;反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃，3 min;然后按94℃，1 min，59℃，1 min，72℃，2 min循環(huán)30次;最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.10 擴(kuò)增產(chǎn)物分析取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(凝膠濃度1%，電壓100 V)，電泳后用溴化乙錠染色及UVI凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取DNA的LAMP擴(kuò)增

圖12 種方法提取模板DNA的LAMP擴(kuò)增Fig.1 Two methods of DNA extraction for amplification by LAMP(A，B)M:DL1000 Marker;1:陰性對(duì)照;2:煮沸法提取DNA;3:TZ法提取DNA

按照1.2.2中的方法提取DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，2種方法提取的DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增后，擴(kuò)增結(jié)果并無明顯區(qū)別。因此，在之后的試驗(yàn)中，選擇簡(jiǎn)便、快捷、成本低的煮沸法提取DNA。

2.2 熱處理殺死副溶血性弧菌

將濃度為1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌活細(xì)胞放入95℃水浴10 min做熱殺死處理，經(jīng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)得:在此條件下可以完全殺死菌此濃度的副溶血性弧菌活細(xì)胞。

2.3 不同濃度EMA對(duì)死菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增的影響

設(shè)定EMA的濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。由圖2A可知，當(dāng)EMA濃度為6.0 μg/mL時(shí)，LAMP擴(kuò)增結(jié)果仍有非常隱約的條帶產(chǎn)生，而當(dāng)其濃度大于等于8.0 μg/mL時(shí)，無條帶產(chǎn)生，說明LAMP擴(kuò)增被抑制;由圖2B可知，當(dāng)EMA濃度小于等于2.0 μg/mL時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶亮度隨EMA濃度的增加而減弱，濃度大于等于4.0 μg/mL時(shí)，無條帶產(chǎn)生，說明PCR擴(kuò)增被抑制。

圖2 不同濃度EMA對(duì)死菌DNA擴(kuò)增的影響Fig.2 Effect of the different concentration of EMA on amplification of DNA from heat killed bacterial cells

2.4 不同濃度EMA對(duì)活菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增的影響

設(shè)定EMA的濃度為0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 μg/mL。由圖3A可知，擴(kuò)增條帶并未隨著EMA濃度的增加而減弱，而是呈現(xiàn)出亮度幾乎無差別的情況，說明不同濃度的EMA對(duì)活菌細(xì)胞DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增無影響，或者影響不大;由圖3B可知，當(dāng)EMA濃度小于等于20 μg/mL時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶亮度隨EMA濃度的增加而有所減弱，當(dāng)EMA濃度達(dá)到40 μg/mL以上時(shí)，無條帶產(chǎn)生，說明高濃度EMA對(duì)活菌細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增有抑制作用。

2.5 EMA最佳曝光時(shí)間的確定

根據(jù)2.3和2.4的優(yōu)化結(jié)果，此處的試驗(yàn)選擇加入EMA的濃度為最小抑制副溶血性弧菌死細(xì)胞的EMA濃度，即8.0 μg/mL。從圖4A、B、C、D可以看出，經(jīng)此濃度的EMA處理后的活菌，無論曝光多長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)LAMP和PCR擴(kuò)增均無影響;經(jīng)此濃度的EMA處理后的死細(xì)胞，曝光時(shí)間為20 min時(shí)，PCR便沒有擴(kuò)增條帶，而LAMP仍有擴(kuò)增條帶，雖然條帶亮度有所減弱，仍可說明沒有完全抑制LAMP擴(kuò)增;當(dāng)曝光時(shí)間大于等于25 min時(shí)，PCR與LAMP對(duì)死細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果為均無擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。表明，無論應(yīng)用哪種方法對(duì)副溶血性弧菌死/活細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)鑒定，EMA光解時(shí)間超過25 min，便能夠達(dá)到區(qū)分死/活菌細(xì)胞的目的。

圖3 不同濃度EMA對(duì)活菌DNA擴(kuò)增的影響Fig.3 Effect of the different concentration of EMA on amplification of DNA from viable bacterial cells

圖4 EMA激活光解的最佳曝光時(shí)間的確定Fig.4 Determination of light exposure time to activate and photolyse EMA

2.6 EMA-LAMP和EMA-PCR擴(kuò)增混合菌中活菌細(xì)胞DNA的比較

3組EMA-LAMP擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果見圖5A、C、E;3組EMA-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果見圖5B、D、F。結(jié)果表明，0.25 mL熱殺死細(xì)胞菌懸液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL經(jīng)無菌胰胨肉湯進(jìn)行10倍比例稀釋的活細(xì)胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的擴(kuò)增結(jié)果，與經(jīng)上述相同處理的活細(xì)胞菌懸液分別混合于0.25 mL無菌水的擴(kuò)增結(jié)果基本一致，擴(kuò)增條帶的亮度隨著活菌數(shù)量的減少而減弱(圖5A、C;B、D)。而且，從圖5A中可得EMA-LAMP的檢出限為1.0×102cfu/mL，從圖5B中可得EMA-PCR的檢出限為1.0×105cfu/mL，說明EMA-LAMP檢測(cè)靈敏度要高于EMA-PCR。圖5E、F為0.25 mL活菌細(xì)胞懸液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL經(jīng)無菌胰胨肉湯進(jìn)行10倍比例稀釋的熱殺死細(xì)胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)中進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增的結(jié)果。從圖5可以看出，LAMP與PCR擴(kuò)增條帶的亮度并無明顯區(qū)別，表明不同數(shù)量熱致死菌的LAMP與PCR擴(kuò)增均被抑制。

圖5 EMA-LAMP和EMA-PCR擴(kuò)增混合菌中活菌細(xì)胞的DNAFig.5 EMA-LAMP and EMA-PCR amplitication of the viable cells from a mixture of viable and dead cells

3 討論

用EMA檢測(cè)細(xì)菌的VBNC雖然有諸多優(yōu)點(diǎn)，但研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的EMA也會(huì)對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用［13］，可抑制活細(xì)胞DNA擴(kuò)增，因此使其應(yīng)用也受到較大的限制。EMA毒副作用與菌液溫度和EMA曝光時(shí)間有關(guān)。因?yàn)闇囟葘?duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性和流動(dòng)性有一定的影響［14］。因此，曝光時(shí)要放在冰上，防止升溫，且需要對(duì)EMA最佳曝光時(shí)間進(jìn)行摸索。在擴(kuò)增混合菌時(shí)，進(jìn)行多次離心去掉EMA，防止除了進(jìn)入死菌細(xì)胞外的多余EMA對(duì)活菌細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。

疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)作為一種高親和力光解DNA染料，結(jié)構(gòu)和作用類似于EMA。PMA能夠與細(xì)菌死細(xì)胞的DNA共價(jià)結(jié)合并抑制其PCR反應(yīng)，使得PCR只能夠檢測(cè)到細(xì)胞膜完整的細(xì)菌活細(xì)胞，而無法檢測(cè)到細(xì)胞外DNA和細(xì)胞膜破損的細(xì)菌死細(xì)胞。將EMA和PMA穿透活細(xì)胞細(xì)胞膜的能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)雖然EMA能穿透厭氧菌的細(xì)胞膜，但是會(huì)造成DNA損失，與此相比，PMA的優(yōu)勢(shì)在于無法穿透厭氧菌的細(xì)胞膜。研究發(fā)現(xiàn)EMA不僅抑制死細(xì)胞擴(kuò)增，也能降低活細(xì)胞擴(kuò)增效率，而PMA只能選擇性抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增。雖然，PMA-PCR檢測(cè)細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)逐漸變成當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，但是有實(shí)驗(yàn)表明PMA抑制死菌擴(kuò)增的用量要大于EMA，而且價(jià)錢比EMA高。所以，目前主要還是應(yīng)用EMA與PCR等技術(shù)結(jié)合進(jìn)行死/活細(xì)胞的鑒定。但無論是應(yīng)用EMA還是PMA，該方法都是結(jié)合了EMA(PMA)選擇滲透性和PCR特異性，作為一種區(qū)分細(xì)胞死活的方法，可以在一定程度上有效檢測(cè)細(xì)菌VBNC細(xì)胞。

本試驗(yàn)針對(duì)副溶血性弧菌種特異性基因tlh作為檢測(cè)的靶基因，采用了一種將DNA染料EMA(ethidium bromide monoazide)與LAMP結(jié)合的分析方法，對(duì)濃度為1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌的活細(xì)胞、熱殺死細(xì)胞和死活混合細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，并與EMA-PCR相比較，結(jié)果如下:①采用煮沸法和TZ法提取DNA作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的模板，發(fā)現(xiàn)2種方法擴(kuò)增的條帶亮度基本無差距，說明采用不同的提取DNA的方法進(jìn)行LAMP擴(kuò)增無影響;②EMA濃度對(duì)副溶血性弧菌活菌LAMP擴(kuò)增幾乎無影響，而抑制PCR擴(kuò)增的最大EMA濃度為40 μg/mL;③抑制副溶血性弧菌死細(xì)胞LAMP擴(kuò)增的最小EMA濃度為8.0 μg/mL，抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最小EMA濃度為4.0 μg/mL。表明，EMA-LAMP抑制死細(xì)胞所用的EMA濃度大于EMA-PCR，也就是說EMA-LAMP更能保證檢測(cè)的靈敏度與準(zhǔn)確性;④選擇8.0 μg/mL的EMA檢測(cè)1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌的活細(xì)胞，確定EMA激活光解進(jìn)入死細(xì)胞中且與DNA結(jié)合的最佳曝光時(shí)間至少為25 min;⑤在用EMA-LAMP和EMA-PCR擴(kuò)增混合菌中活菌細(xì)胞DNA檢測(cè)中，將相同濃度的熱殺死細(xì)胞菌懸液(1.0×108cfu/mL)混合于不同濃度的活細(xì)胞菌懸液中(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的擴(kuò)增結(jié)果與上述活菌細(xì)胞懸液混合無菌水的EMALAMP(EMA-PCR)擴(kuò)增結(jié)果基本一致，說明EMALAMP和EMA-PCR能夠有效區(qū)分混合菌中的活細(xì)胞，且EMA-LAMP的檢出限為1.0×102cfu/mL，EMA-PCR的檢出限為1.0×105cfu/mL，再次證明EMA-LAMP的檢測(cè)靈敏度優(yōu)于EMA-PCR;⑥將相同濃度的活菌細(xì)胞懸液(1.0×108cfu/mL)混合于不同濃度的熱殺死細(xì)胞菌懸液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的EMA-LAMP和EMAPCR擴(kuò)增條帶的亮度并無明顯區(qū)別，表明不同數(shù)量熱致死菌的LAMP(PCR)擴(kuò)增均被抑制。

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