沈雁飛，單穎，柳明杰

(遼寧醫(yī)學(xué)院免疫病原生物學(xué)教研室，遼寧錦州121001)

膽固醇在體內(nèi)有著重要的生理作用，但當(dāng)其過(guò)量時(shí)會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥，并誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦中風(fēng)等心腦血管疾病［1］。隨著國(guó)人生活水平的提高、肉類(lèi)飲食的增加，現(xiàn)代城市人群膽固醇的攝入量普遍超標(biāo)［2］。在不改變飲食習(xí)慣的情況下，降低人體內(nèi)膽固醇含量已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界和食品界關(guān)注的重要課題。臨床實(shí)驗(yàn)證明多種乳酸菌制品具有降低血清膽固醇含量的功效，從而降低心腦血管發(fā)病率［3-6］。利用乳酸菌及其發(fā)酵食品清除體內(nèi)多余的膽固醇，具有安全、價(jià)廉、多重保健等優(yōu)勢(shì)。利用誘變育種技術(shù)可以獲得更加高效、特效乳酸菌［2，5］。本研究利用亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)誘變嗜酸乳桿菌，而后篩選出膽固醇清除性能良好的菌株，并利用大白鼠進(jìn)行試驗(yàn)，為今后生產(chǎn)高效安全的降血清膽固醇乳酸制劑提供優(yōu)良的候選菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，遼寧醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏;亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)、膽固醇和牛膽汁酸鹽，美國(guó)Sigma公司;總膽固醇(TC)及高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)測(cè)定試劑盒，上海榮盛公司;甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒，浙江東頤公司;分光光度計(jì)，上海第三儀器廠;SD大鼠購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(遼)2003-0009)。

1.1.2 主要培養(yǎng)基①M(fèi)RS瓊脂培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基添加1%(質(zhì)量體積比)瓊脂，121℃滅菌20 min后，冷卻制成MRS瓊脂培養(yǎng)基;②膽固醇MRS培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基中添加膽固醇至0.3 g/L，121℃滅菌20 min后，添加等體積無(wú)菌血清制成含膽固醇培養(yǎng)基;③脫脂乳培養(yǎng)基(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)，%):脫脂奶粉10，綿白糖5，混勻后95℃保溫殺菌20 min，待冷卻至40℃左右待用;④高脂飼料配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%):豬油10，膽固醇0.3，基礎(chǔ)飼料89.7。

1.2 方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定嗜酸乳桿菌接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接3次充分活化。將活化嗜酸乳桿菌按3%(體積比)接種量接種到裝有0.2 L MRS培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h取均勻懸浮液20 mL，測(cè)定OD600值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 嗜酸乳桿菌的誘變方法按嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)曲線，取對(duì)數(shù)期嗜酸乳桿菌，充分懸浮后轉(zhuǎn)移到50 mL試管中，加入誘變劑NTG，使其作用濃度為1 g/L，將試管在25℃放置10、20、30、40、50、60 min，離心后利用MRS沖洗3次，逐級(jí)稀釋?zhuān)?0 μL均勻地鋪到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，放置到密閉無(wú)氧箱中，培養(yǎng)24～48 h。根據(jù)對(duì)照，菌落計(jì)數(shù)，確定誘變后10%存活率的條件。以確定的條件進(jìn)行大量突變實(shí)驗(yàn)，挑選在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，個(gè)體較大的黃色誘變菌落，分別進(jìn)行接種傳代，挑選60個(gè)穩(wěn)定的菌株，以Y1～Y60進(jìn)行命名。

1.2.3 耐滲透壓能力的測(cè)定在MRS固體培養(yǎng)基中加人NaCl，使其濃度分別為2%、4%、6%、8%(質(zhì)量體積比)。將誘變菌種劃線接種于含不同濃度NaCl的MRS固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，觀察嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 耐膽酸鹽能力的測(cè)定在MRS培養(yǎng)基內(nèi)加入牛膽酸鹽，使其濃度分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%(質(zhì)量體積比)，菌種按10%(體積比)量接種于0.1 L含牛膽汁酸鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，定時(shí)取樣，以0 h活菌數(shù)量為對(duì)照，記錄嗜酸乳桿菌存活率。

1.2.5 降膽固醇嗜酸乳桿菌的體外篩選按5%(體積比)接種量接種嗜酸乳桿菌于液體MRS膽固醇培養(yǎng)基中，搖勻后立即取2 mL樣品，12 000 r/min離心5 min，取上清測(cè)定膽固醇含量做對(duì)照。剩余接種樣品繼續(xù)在37℃靜止培養(yǎng)48 h后同樣測(cè)定上清膽固醇含量。膽固醇含量測(cè)定方法如下:液體培養(yǎng)基精確稱(chēng)取膽固醇溶于無(wú)水乙醇中做成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)液，并進(jìn)一步利用無(wú)水乙醇配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L的梯度溶液用于繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品0.5 mL與3 mL無(wú)水乙醇和2 mL 50%KOH(質(zhì)量體積比)震蕩混合，在60℃水域加熱10 min，待冷卻后加入0.005 L正己烷并混合均勻。此后加入3 mL蒸餾水，靜置20 min分層，抽取正己烷層2 mL，加入2 mL鄰苯二甲醛，25℃放置10 min后再加入1 mL濃硫酸并混合均勻。最后抽取2 mL測(cè)定OD550值計(jì)算樣品膽固醇質(zhì)量濃度。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組并構(gòu)建高脂模型雄性SD大鼠60只，體重180～220 g之間，普通飼料正常飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組12只:A對(duì)照組，飼喂普通飼料;B高脂組，飼喂高脂飼料;C脂奶組，高脂飼料中添加與D組等量的脫脂奶粉及白糖;D酸奶組，在高脂飼料中按1 L/kg飼料添加酸奶。以上飼料均制成顆粒。大鼠自由飲水進(jìn)食，每隔2 d換新鮮飼料。酸奶是利用接種5%(體積比)的嗜酸乳桿菌到脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h至形成凝乳。

1.2.7 實(shí)驗(yàn)大鼠血脂測(cè)定按1.2.6飼料要求喂養(yǎng)大鼠。在0 d和27 d收集糞便。于0 d和28 d的采血前12 h禁食，稱(chēng)重。血脂測(cè)量采用尾靜脈取血0.001 L，4℃放置過(guò)夜，12 000 r/min低溫離心10 min，分離血清測(cè)定血脂。收集的糞便冷凍干燥后于研缽中磨細(xì)混勻，干燥器中保存待測(cè)。

1.2.8 TC、TG、HDL-C的檢測(cè)方法取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清適量，分別依試劑盒的操作要求采用比色法測(cè)定TC、TG和HDL-C。用分光光度計(jì)測(cè)定TC、TG、HDL-C最終含量。大鼠糞便中的TC:取大鼠糞便粉末0.19 g，用甲醇氯仿混合液45℃水浴提取1 h，鄰苯二甲醛比色法測(cè)定糞便中TC含量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳誘變時(shí)間測(cè)定

研究表明致死率在80%～90%時(shí)導(dǎo)致的突變?yōu)檎蛲蛔儯?，5］。本研究中嗜酸乳桿菌的誘變最佳條件為NTG 1 g/L、30 min，達(dá)到90.31%的致死率。

2.2 耐滲透壓能力的測(cè)定

滲透壓對(duì)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)具有一定的影響，嗜酸乳桿菌耐滲透壓能力是鑒別菌種優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)之一［7］。本研究通過(guò)耐滲透壓能力的測(cè)定顯示，絕大部分突變菌株保留了原菌株較好的耐滲透壓特性。除Y11、Y23、Y25、Y37、Y38、Y44、Y56耐滲透力較差，在NaCl為6%的濃度下就抑制生長(zhǎng)外，其余突變菌株均可拮抗6%濃度NaCl生長(zhǎng)。具有良好的耐滲透壓特性提示突變菌株具有良好的適應(yīng)性，在發(fā)酵成乳酸制品、混合飼料及食用乳酸制品過(guò)程中可保持理想的生物學(xué)活性。

2.3 耐膽酸鹽能力的測(cè)定

膽鹽是膽汁的重要成分，在人體中以膽酸鈉鹽為主要存在方式。膽鹽對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。嗜酸乳桿菌在進(jìn)入十二指腸后暴露在膽鹽中，如果不具備抗膽鹽能力，就會(huì)喪失其生物學(xué)活力，從而降低其降膽固醇的功能，所以?xún)?yōu)良的嗜酸乳桿菌需要具備良好的抗膽鹽能力［7］。本研究中耐膽酸鹽能力的測(cè)定表明，在挑選的60株突變菌株中，除去耐滲透壓能力較差的以上7株嗜酸乳桿菌株外的53株突變株中，有8株嗜酸乳桿菌突變株，包括Y13、Y17、Y26、Y27、Y33、Y39、Y48、Y50，具有較好的耐膽鹽能力。由圖1可知，突變菌株Y27和Y48嗜酸乳桿菌在膽鹽0.5%濃度條件下1 h存活率均超過(guò)50%，Y48在0.5%濃度條件下1 h存活率達(dá)到64.87%，2 h存活率達(dá)到33.17%。Y27和Y48在1%濃度2 h存活率均分別達(dá)到15.86%和21.24%。從圖示可以了解Y27和Y48突變菌株與原菌株的耐膽鹽能力相似，具有良好的抗膽鹽能力，為在高膽鹽的消化道環(huán)境中發(fā)揮正常生理功能奠定基礎(chǔ)。

圖1 乳酸桿菌在膽鹽中的存活率分析Fig.1 Survival rate of Lactobacillus acidophilus in MRS contained bile salts

2.4 誘變嗜酸乳桿菌清除膽固醇能力測(cè)定

在進(jìn)行耐滲透壓、抗膽鹽實(shí)驗(yàn)以后，利用獲得的8株突變菌進(jìn)行體外降膽固醇實(shí)驗(yàn)。嗜酸乳桿菌對(duì)降膽固醇篩選培養(yǎng)基中膽固醇的脫除率見(jiàn)圖2。在含有膽固醇的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，Y27和Y48體現(xiàn)出良好的清除膽固醇能力，膽固醇清除率分別達(dá)到了(53.43±2.3)%和(61.44±1.8)%。比較原嗜酸乳桿菌，Y27和Y48膽固醇清除率分別提高了61.32%和85.51%。

圖2 乳酸桿菌膽固醇清除率分析Fig.2 Clearance rate of cholesterol by Lactobacillus acidophilus

2.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

對(duì)原嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定可以用于確定良好的突變時(shí)機(jī)，對(duì)于已經(jīng)完成突變的嗜酸乳桿菌進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定可以更好地了解突變菌的生長(zhǎng)特征。如圖3所示，原嗜酸乳桿菌和Y27及Y48的生長(zhǎng)曲線相似，突變的嗜酸乳桿菌Y27和Y48與原嗜酸乳桿菌均在培養(yǎng)16～18 h進(jìn)入平臺(tái)期。經(jīng)過(guò)18 h培養(yǎng)，原菌株、Y27和Y48的細(xì)菌計(jì)數(shù)分別為1.79×1012、1.81×1012和1.92×1012cfu/L。以上結(jié)果均提示突變的菌株Y27和Y48除具有良好的耐滲透壓、抗膽鹽能力外，并沒(méi)有喪失良好的生長(zhǎng)能力。

2.6 發(fā)酵乳對(duì)大鼠TC、TG、HDL-C的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證突變嗜酸乳桿菌的降膽固醇能力，本研究選取體外篩選得到的體外降膽固醇能力最高的乳酸突變菌Y48發(fā)酵酸奶，并按照1.2.6分組進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。28 d后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠血脂水平見(jiàn)表1。高脂組血清TC含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，說(shuō)明高脂模型已成功建立。酸奶組的血清TC和TG含量比高脂組顯著降低(P＜0.05)。而奶脂組與高脂組相比有所升高但差異不大，說(shuō)明未發(fā)酵奶本身并沒(méi)有降膽固醇作用。與高脂組相比，酸奶組大鼠的HDL-C并沒(méi)有顯著的差異(P＞0.05)，間接說(shuō)明酸奶組的低密度膽固醇要低于高脂組。實(shí)驗(yàn)大鼠的體重變化觀察表明，酸奶組的體重明顯低于高脂組和奶脂組(P＜0.05)。

圖3 各乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線分析Fig.3 Growth curve of Lactobacillus acidophilus

如圖4所示，實(shí)驗(yàn)大鼠奶脂組、高脂組和酸奶組糞便內(nèi)膽固醇含量均高于對(duì)照組。其中酸奶組大鼠糞便中的膽固醇含量最高，比對(duì)照組高350.31%，比高脂組高116.67%，比奶脂組高110.42%，說(shuō)明突變菌株Y48的發(fā)酵乳可以清除更多的腸道中的TC，從而減少TC在腸道中的吸收。

圖4 乳酸桿菌發(fā)酵奶對(duì)大鼠糞便中TC含量影響的分析Fig.4 Concentration of TC in feces after feeding with yogurt

3 討論

本研究旨在利用NTG誘變嗜酸乳桿菌獲得降膽固醇的優(yōu)良菌株。利用NTG作用濃度為1 g/L，作用時(shí)間為30 min的條件進(jìn)行誘變后，從挑選的生長(zhǎng)良好的60個(gè)突變菌株中篩選出Y48突變菌株。Y48突變菌株與原菌株保持相似的生長(zhǎng)速度，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后菌濃度達(dá)到了1.92×1012cfu/L。Y48菌株具有良好的耐滲透壓能力，在6%的NaCl瓊脂MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。此菌株也具有良好的抗膽鹽能力，在0.5%膽酸MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h的存活率可達(dá)到64.87%。Y48菌株在含膽固醇MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，降膽固醇(61.44±1.8)%。利用高脂肪飼料喂養(yǎng)SD大鼠，并在飼料中添加Y48發(fā)酵乳，28 d后Y48發(fā)酵乳組血清TG、TC比高脂肪模型組明顯降低(P＜0.05)。糞便中的TC明顯升高。以上實(shí)驗(yàn)成功獲得了優(yōu)質(zhì)的降膽固醇乳酸桿菌Y48，為生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)降膽固醇發(fā)酵乳制品提供了優(yōu)良的候選菌種。

表1 乳酸桿菌對(duì)大鼠血清中膽固醇影響分析Table 1 Influence of yogurt on serum lipids and body weigh of SD rats

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