金浩，李柏林，歐杰，陳蘭明*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306;2.上海海洋大學(xué)，上海201306)

活性污泥法是工業(yè)化國(guó)家最常見(jiàn)的污水生物應(yīng)用處理技術(shù)。用于處理生活廢水及工廠污水的活性污泥成分復(fù)雜，不僅有來(lái)自于污水的難降解有機(jī)物，被污泥絮體吸附的無(wú)機(jī)物，還包括有代謝功能的活性微生物群體，微生物內(nèi)源呼吸和自身氧化的殘留物。能降低污水中復(fù)雜成分的材料是一種生物性的絮狀材料，主要有腐生性營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌、原生動(dòng)物和細(xì)胞外高分子物質(zhì)(EPS)［1］。微生物不僅參加一些小分子細(xì)胞新陳代謝，而且通過(guò)酶的水解作用使得大部分大分子有機(jī)物通過(guò)一系列的水解反應(yīng)變成可被細(xì)菌細(xì)胞吸收系統(tǒng)吸收的較小單位的物質(zhì)。而這些未知的微生物蘊(yùn)含著一個(gè)寶貴的有可能獲得新酶的潛在資源。近年來(lái)，宏基因組技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用在從各種環(huán)境中的未培養(yǎng)微生物中獲得新型微生物產(chǎn)物［2］。本研究通過(guò)非培養(yǎng)宏基因組技術(shù)研究位于中國(guó)上海污水處理系統(tǒng)中活性污泥的多樣性。要在如此復(fù)雜的樣品中獲得較為純凈且完整度高的DNA具有一定難度。本實(shí)驗(yàn)宏基因組DNA的提取方法是根據(jù)Zhou J等［3］提出的原位提取法并做了一些修改，以保持環(huán)境樣品中DNA的完整性和純度，并通過(guò)16S rDNA PCR來(lái)驗(yàn)證活性污泥宏基因組DNA的細(xì)菌多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集樣品來(lái)自污水處理工廠(處理工業(yè)和市政廢水，上海)，用無(wú)菌采樣袋裝盛并密封，立即存于冰盒運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑DNA提取緩沖液:Tris-HC1 100 mmol/L，EDTA 100 mmol/L，NaCl 1.5 mol/L和1%(質(zhì)量體積比)溴化十六烷基三甲基銨(Sigma-Aldrich，美國(guó))，pH 8.0;Premix Ex Taq，購(gòu)自上海生工生物有限公司;Axygen DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 活性污泥宏基因組DNA的提取活性污泥總DNA具體的提取方法如下:取活性污泥樣品50 g和135 mL的DNA提取緩沖液加入到150 mL離心管中，置于37℃充分混合0.5 h。然后加入0.5 mL蛋白酶K和2.0 mL 20%SDS溶液，置于50℃水浴反應(yīng)3 h，并每20 min上下顛倒混勻。在25℃下6 000 r/min離心10 min，收集上清液，然后加入等體積氯仿/異丙醇(24∶1)混合液，上下顛倒混勻后，4℃，12 000 r/min離心10 min，吸取含有DNA的上層水相。向水相中加入0.1倍水相體積3 mol/L醋酸鈉(pH 5.3)和2倍水相體積無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻30 s，放在-20℃2 h。然后4℃，13 000 r/min離心15 min。去掉上清液，加入2 mL 70%乙醇洗滌，洗掉酒精并晾干。用200 μL Mili-Q無(wú)菌水溶解宏基因組DNA，-20℃保藏。

1.2.2 宏基因組DNA純化及濃度測(cè)定通過(guò)割膠回收對(duì)DNA進(jìn)行純化處理，方法參照Axygen DNA凝膠回收試劑盒，回收的宏基因組DNA的濃度通過(guò)SAM1000分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 16S rDNA PCR擴(kuò)增DNA的提取質(zhì)量通過(guò)進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR。PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)體系為DNA模板1 μL，Premix Ex Taq 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O添至總體積為20 μL。16S PCR的通用引物為27F和1492R，上游引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物1492R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR反應(yīng)條件:最初變性溫度的95℃5 min;隨后94℃變性30 s，58.3℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)是通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)割膠回收純化。

1.2.4 16S rDNA文庫(kù)的建立純化后的PCR產(chǎn)物與pGM-T載體(TaKaRa中國(guó)大連)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞(上海生工生物有限公司)中，涂布于表面加入16 μL的IPTG(50 mg/mL)、40 μL X-gal(20 mg/mL)的LB(Amp+)固體培養(yǎng)基上，隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆于LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒并送上海生工生物公司測(cè)序。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立將16S rDNA的核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，并獲得相似種屬。序列以FASTA格式輸入BioEdit，并用Clustal W2功能進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果輸入分析軟件MEGA4(version 4.0)中，激活后進(jìn)行neighborjoining建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性污泥的宏基因組DNA提取

直接法提取到的DNA呈深褐色并伴有大量絮狀物，說(shuō)明DNA粗提液中仍然包含著各種一同抽提出來(lái)的色素或其他雜質(zhì)。

圖1 活性污泥宏基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of metagenomic DNA extracted from activated sludge sample M:λDNA/HindⅢladder;1～3:提取的宏基因組DNA M:λDNA/HindⅢladder;1～3:Metagenomic DNA extracted

由圖l可知，提取的DNA片段大約23.1 kb，電泳拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，說(shuō)明DNA純度不高。條帶亮度高說(shuō)明DNA提取量很高。經(jīng)過(guò)割膠純化后，DNA純度提高，片段大小幾乎沒(méi)有改變。

2.2 16SrDNA PCR克隆文庫(kù)建立

以活性污泥總DNA為模板擴(kuò)增得到約1.5 kb的16S rDNA產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小相符。

測(cè)序共獲得195條高質(zhì)量16S rDNA序列，通過(guò)Blast程序進(jìn)行比對(duì)檢索，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2，得到與序列最相似的細(xì)菌種類。比對(duì)結(jié)果表明，活性污泥16S rDNA克隆文庫(kù)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列均來(lái)自于環(huán)境樣品，與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知16S rDNA序列的相似性均高達(dá)97%以上。

圖2 16SrDNA克隆文庫(kù)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖Fig.2 Phylogenetic tree of deduced carboxypeptidase amino acid sequences obtained from microbial community of activated sludge samples

195個(gè)克隆中，變形菌門(mén)是最明顯的優(yōu)勢(shì)類群。包括β-變形菌門(mén)(β-Proteobacteria)中產(chǎn)堿桿菌屬Alcaligenes(107個(gè)克隆)、Aquabacterium(1個(gè)克隆)、Oxalicibacterium(1個(gè)克隆)、Massilia(1個(gè)克隆)、Comamonas(1個(gè)克隆);γ-變形菌門(mén)(γ-Proteobacteria)中Oceanimonas(3個(gè)克隆)、Oceanisphaera(1個(gè)克隆)、Enterobacter(3個(gè)克隆)、Vibrio(6個(gè)克隆)、Pseudomonas(25個(gè)克隆)、Acineto-bacter(2個(gè)克隆)、Xanthomonas(3個(gè)克隆)、Stenotrophomonas(25個(gè)克隆)。其余克隆子鑒定到菌屬水平的包括:厚壁胞門(mén)(Firmicutes)中芽胞桿菌屬Bacillus(4個(gè)克隆)、腸球菌屬Enterococcus(4個(gè)克隆)、漫游球菌屬Vagococcus(1個(gè)克隆);擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)中Myroides(4個(gè)克隆);硝化螺菌門(mén)(Nitrospirae)中Candidatus Nitrospira defluvii(2個(gè)克隆);綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)中Herpetosiphon(1個(gè)克隆)。

3 討論

宏基因組DNA的提取是研究活性污泥樣品的第一步，DNA的提取包含DNA產(chǎn)量、DNA純度和DNA對(duì)整個(gè)微生物群落的代表性等方面。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為活性污泥樣品，其復(fù)雜的物理特性及物質(zhì)成分無(wú)法用現(xiàn)有的試劑盒提取DNA，因此選擇直接法對(duì)樣品進(jìn)行提取宏基因組DNA。根據(jù)Zhou J等提出的原位提取法，抽提的宏基因組DNA電泳圖顯示出本實(shí)驗(yàn)的提取方法可以獲得較高濃度且保持較大長(zhǎng)度的DNA片段，同時(shí)DNA粗提液顏色呈黃褐色，仍包含很多雜質(zhì)，需要進(jìn)一步純化。

污水處理活性污泥16S rDNA文庫(kù)中的克隆Blast比對(duì)結(jié)果顯示，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的最相似序列基本來(lái)自于環(huán)境樣品，文庫(kù)中的序列與已培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA序列相似性高于97%，即鑒定到菌屬。結(jié)果表明，污水處理活性污泥的微生物以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主。本研究還在活性污泥中發(fā)現(xiàn)了綠彎菌門(mén)和硝化螺菌門(mén)細(xì)菌類群。這些結(jié)果說(shuō)明，污水處理活性污泥中微生物種類非常豐富，且部分克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中未培養(yǎng)的環(huán)境細(xì)菌序列最相似，若單純利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法對(duì)活性污泥菌群進(jìn)行研究是不充分的。16S rDNA克隆文庫(kù)方法為活性污泥細(xì)菌多樣性提供一個(gè)更加全面的認(rèn)識(shí)，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行功能研究有極大幫助，包括特定培養(yǎng)基的設(shè)定以及相關(guān)基因序列的搜索。但對(duì)活性污泥的真核生物多樣性研究則需建立18S rDNA文庫(kù)。

本研究的16S rDNA克隆比對(duì)結(jié)果顯示出3個(gè)較優(yōu)勢(shì)的菌屬。近55%的克隆與Alcaligenes feacalis相似性高達(dá)99%，產(chǎn)堿桿菌屬存在于各種環(huán)境中并可以分泌蛋白酶［4］、幾丁質(zhì)酶［5］、腈水解酶［6］等，對(duì)污水中的有機(jī)質(zhì)有水解作用，其硝化作用也可將污水中的氮元素降解為N2O或N2［7］。與25個(gè)克隆相似度為98%的優(yōu)勢(shì)菌為Pseudomonas aeruginosa，假單胞菌是一種廣泛分布于自然界的常見(jiàn)的病菌，是自然界中碳、氮循環(huán)的重要一環(huán)［8］，分解蛋白質(zhì)和酯酶能力很強(qiáng)［9］。同樣有25個(gè)克隆與已知序列相似性高達(dá)99%的菌為Stenotrophomonas sp.，Stenotrophomonas sp.最初被分作假單胞菌屬，后被確認(rèn)為寡養(yǎng)單胞菌屬，寡言單胞菌同樣有很強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力［10］和產(chǎn)酯酶能力。亞硝酸鹽氧化細(xì)菌Candidatus Nitrospira defluvii，是一個(gè)在處理工業(yè)污染和廢水的生物污水處理系統(tǒng)中［11］重要的硝化細(xì)菌。W35序列顯示了與Comamonas的98%的相似之處，這種菌被普遍發(fā)現(xiàn)在源于城市和工業(yè)廢水處理廠的活性污泥樣品［12］。另外還有自然的清道夫之稱的Herpetosiphon aurantiacus［13］，W33相似度為99%。這類細(xì)菌曾出現(xiàn)在污染水體中，說(shuō)明它們可能在活性污泥中對(duì)污水處理過(guò)程發(fā)揮重要的生物處理功能。

同時(shí)，Alcaligenes feacalis是機(jī)會(huì)致病菌［14］，可以引起敗血癥、嬰兒腦膜炎等。Pseudomonas是一種致病力較低但抗藥性強(qiáng)的桿菌［15］，常見(jiàn)于傷口感染，也能產(chǎn)生多種與毒力相關(guān)的物質(zhì)，如外毒素a。

本研究通過(guò)16S rDNA克隆文庫(kù)方法初步分析了污水處理活性污泥中微生物群落的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)活性污泥中微生物種類很豐富，包括可能執(zhí)行很復(fù)雜的污水生物處理功能的微生物;同時(shí)，活性污泥中也存在著極多的細(xì)菌病原體。

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