劉堅，林汲，雷振河，呂利華，趙良啟

1(山西大學化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西太原，030006)2(山西三盟實業(yè)發(fā)展有限公司，山西太原，030032)3(山西杏花村汾酒集團有限責任公司，山西汾陽，032205)

汾酒作為清香型白酒的代表，以其優(yōu)良品質(zhì)馳名中外，經(jīng)久不衰［1］。汾酒生產(chǎn)是以汾酒大曲特定微生物群落做為生物作用劑，群落結(jié)構(gòu)菌群依次消長、順序代謝完成釀造，因此環(huán)境因素和操作條件對酒醅發(fā)酵的影響很大。在實際生產(chǎn)中，一個突出的問題是夏季酒醅總酸度常常偏高，影響了酒的品質(zhì)和出酒率，造成經(jīng)濟效益下降。不僅汾酒生產(chǎn)如此，全國白酒行業(yè)也普遍存在這個共性問題，亟需解決［2］。

本研究通過HPLC分析了夏季酒醅中有機酸的組成，采用平板劃線法分離得到了正常酒醅和酸度過高酒醅中的產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)乳酸細菌?？疾飙h(huán)境溫度、入缸水分和裝料量等對出缸酒醅總酸度的影響，最后通過響應(yīng)面試驗對汾酒釀造過程進行優(yōu)化，獲得優(yōu)質(zhì)汾酒的最佳釀造條件，為汾酒“自動化控制，機械化生產(chǎn)”提供理論依據(jù)［3］。

1 材料和方法

1.1 原料和儀器

高粱(705)、大曲、夏季正常酒醅和酸度過高酒醅，汾酒廠提供;2L的陶瓷罐;分析純標準品:丙酸、草酸、丙酮酸、甲酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、戊二酸;優(yōu)級純硫酸、超純水。

主要儀器:2487型雙波長檢測器(Waters公司)、PRP-X 300 離子排斥色譜柱(7 μm，250 mm ×4.6 mm)。

1.2 試驗方法

1.2.1 夏季酒醅中有機酸的測定

1.2.1.1 有機酸標準液和酒醅上樣液的配制

分別按質(zhì)量稱取不同的有機酸標品，用去離子水定容至100 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，稀釋為不同濃度梯度的標準溶液。取20 g酒醅，用40 mL蒸餾水浸出(約30 min)其可溶性成分，普通濾紙減壓抽濾后，10 000 r/min離心10 min，0.22 μm 濾膜過濾，得到上樣液。

1.2.1.2 色譜條件

柱溫:25℃;色譜柱:PRP－X 300離子排斥柱;檢測:紫外雙波長檢測器210 nm;流動相:0.05 mmol/L硫酸溶液(0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾，超聲波脫氣 30 min);流速:1 mL/min;進樣量:15 μL;在此色譜條件下上樣，分別檢測各有機酸的標準品和酒醅樣品，以出峰時間定性，以峰面積定量。

1.2.2 產(chǎn)酸細菌的分離

1.2.2.1 培養(yǎng)基

乙酸細菌培養(yǎng)基:酵母膏10 g，葡萄糖100 g，Ca-CO320 g，瓊脂 20 g，自來水 1 000 mL，制霉素 50 μg/mL，乙醇 1%，pH 6.8。

乳酸細菌培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，酵母膏10 g，牛肉膏 10 g，葡萄糖10 g，番茄汁100 mL，CaCO32 g，吐溫80 0.5 mL，瓊脂 15 g，胡蘿卜 40 g，溴甲酚綠0.1 mL，自來水 900 mL，制霉素 50 μg/mL，pH 6.5。

1.2.2.2 產(chǎn)酸菌的分離

分別稱取正常和酸度過高酒醅10 g，溶于100 mL無菌水中搖勻，梯度稀釋，涂布于乙酸菌培養(yǎng)基和乳酸菌培養(yǎng)基上，每個梯度涂布3個。將涂布好的平皿按產(chǎn)乙酸細菌好氧培養(yǎng)和產(chǎn)乳酸細菌厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)時間依菌落生長狀況而定(3～7 d)，最后進行計數(shù)，分別算出正常和酸度過高酒醅中的醋酸菌和乳酸菌數(shù)。

1.2.3 影響酒醅總酸度條件試驗

1.2.3.1 酒醅出缸總酸度測定方法

稱取200 g酒醅加入200 mL蒸餾水，攪拌30 min后靜置10 min，取其液體50 g置于250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，充分振蕩后抽濾(抽濾后液體透明，不影響后面滴定時顏色變化)，取過濾液30 mL于燒杯中用0.1 mol/L NaOH進行酸度滴定，重復(fù)滴定3次，取平均值N(單位:mL)用于酸度的計算。酸度定義:1 g酒醅消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH，即為1個酸度，單位(0.1 mol NaOH mL/g酒醅)。酸度計算公式:

1.2.3.2 影響酒總醅酸度條件的摸索

(1)入缸溫度試驗:酒醅分別在30～40℃、20～30℃和10～20℃之間入缸。(2)發(fā)酵環(huán)境溫度試驗:酒醅入缸后分別置于20、25和30℃下發(fā)酵。(3)入缸水分試驗:以43%、53%和63%的酒醅入缸水分進行發(fā)酵。(4)大曲加量試驗:酒醅入缸時大曲加量分別為5%、10%和20%進行發(fā)酵。(5)入缸裝料量試驗:酒醅在入缸時分別按每缸裝0.4 kg(2L的陶瓷罐，下同)、0.65 kg和0.9 kg進行發(fā)酵。以上各試驗均平行做3缸且只改變1個因素，其他因素按汾酒操作工藝執(zhí)行，發(fā)酵完成測定其總酸度，算出平均酸度。

1.2.4 汾酒釀造工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken的中心組合原理進行三因素三水平實驗。三因素分別為發(fā)酵的環(huán)境溫度、入缸水分和每缸裝料量(簡稱:裝料量)。響應(yīng)面試驗設(shè)計的試驗因素和水平見表1。

表1 試驗因素設(shè)計表

2 結(jié)果與分析

2.1 夏季酒醅中有機酸的測定

有機酸標準品進行HPLC檢測，確定有機酸標品的保留時間、回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 有機酸標品的保留時間、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

對酒醅上樣液進行檢測，共檢測到7種有機酸，依出峰順序分別為:草酸(0.016 g/100g酒醅，單位下同)、丙酮酸(0.12)、甲酸(0.054)、檸檬酸(0.032)、乳酸(0.5)、乙酸(0.385)和琥珀酸(0.049)(見圖1)。由此可知，酒醅中有機酸以乙酸和乳酸含量最多。

圖1 夏季酒醅HPLC分析圖譜

2.2 產(chǎn)酸菌的分離結(jié)果

以溴甲酚綠為指標劑，根據(jù)變色情況挑選產(chǎn)酸細菌;在醋酸菌培養(yǎng)基上，以乙醇為脅迫條件，篩選產(chǎn)乙酸細菌。從正常酒醅中分離到23株產(chǎn)乙酸細菌，5株產(chǎn)乳酸細菌;從酸度過高酒醅中分離到產(chǎn)乙酸菌22株，產(chǎn)乳酸菌29株。表明，正常和酸度過高酒醅中乙酸菌的含量大致相同，而酸度過高酒醅中乳酸菌的含量顯著高于正常酒醅，這也證明了課題組前期的研究結(jié)果:酒醅總酸度過高是乳酸造成的［4］。

2.3 影響酒醅總酸度條件試驗結(jié)果

2.3.1 入缸溫度試驗

酒醅平均酸度分別為3.63(10～20℃)、3.68(20～30℃)和3.65(30～40℃)，可知酒醅的入缸溫度對酒醅的出缸酸度基本沒有影響。

2.3.2 發(fā)酵的環(huán)境溫度試驗

酒醅平均酸度分別為3.17(20℃)、3.63(25℃)和3.96(30℃)。由此可知，環(huán)境溫度對酒醅的出缸總酸度有較大的影響(圖2)。

圖2 酒醅發(fā)酵環(huán)境溫度試驗結(jié)果

2.3.3 酒醅入缸水分試驗

酒醅平均酸度分別為3.52(43%)、3.63(53%)和5.37(63%)。由此可知，酒醅的入缸水分對酒醅出缸酸度有明顯的影響(見圖3)。

圖3 酒醅入缸水分試驗結(jié)果

2.3.4 酒醅入缸時大曲加量試驗

酒醅平均酸度分別為3.6(5%)、3.63(10%)和3.61(20%)。由此可知，大曲加量對酒醅出缸總酸度沒有明顯的影響。

2.3.5 酒醅入缸時裝料量試驗

酒醅平均酸度分別為4.47(0.4 kg)、3.9(0.65 kg)和2.76(0.9 kg)。由此可知，每缸裝料量對酒醅的出缸酸度有顯著的影響(見圖4)。

圖4 酒醅入缸時裝料量試驗結(jié)果

由此可知，入缸溫度和大曲加量的變化對酒醅出缸總酸度的影響不大，但發(fā)酵的環(huán)境溫度、入缸水分和每缸裝料量對酒醅出缸總酸度有較大的影響。

2.4 汾酒釀造工藝優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

環(huán)境溫度、入缸水分和裝料量對酒醅出缸總酸度的響應(yīng)面實驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果

2.4.2 響應(yīng)面模型分析

以酒醅的總酸度做為響應(yīng)值，采用Design-Expert7.1.6對試驗結(jié)果(見表3)進行回歸分析，得到方差分析結(jié)果(見表4)和二次回歸方程為:

由表4可知，環(huán)境溫度、入缸水分和裝料量對酒醅的出缸總酸度的影響達到極顯著水平(P＜0.01)，表明三因素對酒醅出缸總酸度線性效應(yīng)極顯著。所有二次項都達到顯著水平(P＜0.05)，說明三因素對酒醅的出缸總酸度的影響有顯著的交互作用，其中AB和BC項之間的交互作用還達到了極顯著的水平(P＜0.01)。從表4中還可知此模型的P＜0.01，說明該二次方程達到極顯著水平，并且失擬項為0.660 3，遠大于0.05，不顯著，所以該方程能夠很好的解釋各因素與相應(yīng)值之間的真實情況。

2.4.3 三維響應(yīng)面圖譜

由于二次項均達到顯著水平，所以各因素對出缸酸度不是簡單的線性關(guān)系，根據(jù)Design-Expert軟件做出響應(yīng)面圖。

表4 方差分析結(jié)果

由圖5～圖7可知，酒醅的出缸總酸度隨著環(huán)境溫度的增大而變大，入缸水分在51%左右時酒醅的總酸度最小，加大或減小入缸水分都會使出缸酒醅總酸度升高，而隨著裝料量的增加酒醅的出缸總酸度會降低。經(jīng)模型軟件分析最終得到汾酒釀造的最佳酒醅出缸總酸度條件是:環(huán)境溫度為19.33℃、入缸水分為51.28%、每缸裝料量為0.83 kg，出缸酒醅的總酸度為2.07。

圖5 環(huán)境溫度與入缸水分交互作用圖

圖6 環(huán)境溫度與加料量交互作用圖

2.4.4 優(yōu)化工藝驗證實驗

圖7 入缸水分和加料量的交互作用圖

為了證實試驗結(jié)果的可靠性，以最佳酒醅出缸酸度條件修正值(以便于操作)，即環(huán)境溫度20℃，入缸水分51%，每缸裝料量0.83 kg，進行了3組汾酒釀造驗證實驗，最后酒醅的出缸平均酸度為2.12，與預(yù)測值相近，試驗優(yōu)化的模型可靠。

3 討論

通過HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)酒醅中共有7種有機酸，其中乙酸和乳酸的含量最多，通過平板劃線法分別篩出正常和酸度過高酒醅中的產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)乳酸菌，酸度過高酒醅中的乳酸菌含量明顯高于正常酒醅，這更證實了引起酒醅總酸度較高的原因是乳酸菌的不正常代謝［5］。

基于汾酒的釀造，是以特定的生物作用劑(大曲或小曲)作為發(fā)酵劑，即通過特定結(jié)構(gòu)的微生物群落的依次生長和順序代謝完成釀造過程。因此，通過調(diào)節(jié)環(huán)境因素和操作條件控制功能菌的消長次序和代謝方向就顯得十分重要。環(huán)境溫度的高低會影響酒醅溫度的變化，酒醅溫度過高會不利于產(chǎn)酒酵母生長和乙醇合成，而有利于產(chǎn)酸細菌的生長和有機酸過量合成。入缸水分過高，會使酒醅中的氧氣減少，更有利于乳酸菌生長，會使酒醅中乳酸過高;而入缸水分過低，會加大酒醅中的氧氣含量，促進好氧乙酸菌的生長與代謝，導(dǎo)致酒醅中乙酸濃度增加，這就是入缸水分過高或過低均會使酒醅酸度增加的原因。入缸裝料量與酒醅酸度的關(guān)系也可用調(diào)節(jié)氧氣濃度，控制好氧產(chǎn)酸菌生長與代謝的機理來解釋。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面法試驗，發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度20℃，入缸水分51%，裝料量0.83 kg，為最佳優(yōu)化條件，此條件下，出缸平均總酸度為2.12。本研究揭示了汾酒釀造過程中導(dǎo)致酒醅酸度過高的內(nèi)在原因，通過改變釀造工藝達到了降酸保醅的目的［6］，為提高汾酒的質(zhì)量和產(chǎn)量提供技術(shù)參數(shù)，進而為汾酒廠實現(xiàn)“自動化控制，機械化生產(chǎn)”奠定了一定基礎(chǔ)。然而若將此工藝用于汾酒的生產(chǎn)實踐還需進行放大試驗研究。

［1］ 熊子書.中國三大香型白酒的研究(三)清香·杏花村篇［J］．釀酒科技，2005(7):17－21.

［2］ 陳俊平.談清香型大曲酒生產(chǎn)如何創(chuàng)新控酸保醅［J］．釀酒，2009，36(5):30 －31.

［3］ 佟曉群.中國白酒158計劃正式啟動［N］．中國食品報，2011－05.

［4］ 趙佳，雷振河，呂利華，等.汾酒產(chǎn)酸細菌的分離鑒定及其產(chǎn)酸條件研究［J］．食品與發(fā)酵工，2009，35(12):42－46.

［5］ 王牛牛，雷振河，呂利華，等.以紅曲霉酯化酶催化合成乳酸乙酯［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(1):73－77.

［6］ 李增勝.提高汾酒質(zhì)量和產(chǎn)量的探討［J］．釀酒科技，2005(4):104－105.