張生克，閆世梁，黃惠英，史小利，李林，朱騰躍，崔鳳霞

(鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司技術(shù)中心，河南 鄭州，450001)

D-核糖是五碳糖，生物體內(nèi)核糖核酸、核苷酸輔酶類的構(gòu)成成分，又是一種還原型誘導(dǎo)物，承擔(dān)生物體內(nèi)重要活性功能?？蓮V泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥工業(yè)，是合成VB2的重要原料，也是合成抗病毒、抗腫瘤藥物的中間體［1］。分批發(fā)酵法是目前工業(yè)生產(chǎn)D-核糖最普遍的方法，但生產(chǎn)效率低、投資大，且勞動(dòng)強(qiáng)度大，連續(xù)發(fā)酵是新興的發(fā)酵工藝［2－4］，具有簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定、連續(xù)的優(yōu)點(diǎn)。因此，我們進(jìn)行了D-核糖連續(xù)發(fā)酵過程的研究，探求工業(yè)生產(chǎn)上采用連續(xù)發(fā)酵的可能性，為提高D-核糖的發(fā)酵生產(chǎn)水平提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)轉(zhuǎn)酮醇酶(Transketolase)變異株XB02，由鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司技術(shù)中心保藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

采用GRJD型自控式發(fā)酵罐，由5L種子罐和30L發(fā)酵罐組成，鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司制造。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 肉湯培養(yǎng)基

牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、可溶性淀粉2.0%、NaC1 0.5%、酵母膏0.1%，pH 7.0，加入瓊脂2.0%則為固體培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基用于菌種的保藏、擴(kuò)增及活化等。

1.3.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖2.0%、酵母膏 0.35%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%，pH 7.0。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20%、玉米漿3%、(NH4)2SO40.6%、CaCO33.6%、MnSO4·4H2O 0.005%，pH 7.0。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 種子制備

將保藏菌種接入搖瓶培養(yǎng)基中36℃，200 r/min，培養(yǎng)12～20 h，然后轉(zhuǎn)接至5 L種子罐中，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，溫度 36℃，壓力 0.06 MPa，通氣量0.5(vvm)，培養(yǎng)16～24 h。

1.4.2 連續(xù)發(fā)酵流程

單級(jí)連續(xù)發(fā)酵在30 L自控發(fā)酵罐中進(jìn)行。在一定底物濃度下，先進(jìn)行分批發(fā)酵，待菌體生長(zhǎng)到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末時(shí)轉(zhuǎn)入連續(xù)發(fā)酵，控制稀釋率，即將儲(chǔ)罐中滅過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基通過蠕動(dòng)泵連續(xù)流加入發(fā)酵罐，同時(shí)溢流口連續(xù)溢出發(fā)酵液以保持發(fā)酵體積不變。發(fā)酵溫度控制在(35±0.5)℃，罐壓為0.08 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速 360 r/min，通氣量為 1∶0.5(v/v/m)。

1.5 測(cè)定方法

D-核糖含量的檢測(cè):采用苔黑酚法［5］。

菌體生長(zhǎng)量(OD值)的測(cè)定:用蒸餾水稀釋發(fā)酵液40倍，以蒸餾水作空白，用721分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在590 nm處的光密度。

殘?zhí)呛?采用SBA-40C型生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.6 計(jì)算方法［6］

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)發(fā)酵起點(diǎn)的確定

研究表明，可以通過分批發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線和糖利用曲線等來判斷連續(xù)發(fā)酵起點(diǎn)。Daniel［7］等判斷連續(xù)發(fā)酵起點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)是:正常分批發(fā)酵的條件下，當(dāng)O2的吸收率快速上升、光密度達(dá)到分批發(fā)酵條件下可能達(dá)到的最大光密度的40% ～80%時(shí)，開始以一定的稀釋率放料，隨之轉(zhuǎn)為連續(xù)發(fā)酵的操作方式。圖1為分批發(fā)酵過程中OD590nm、溶氧、殘?zhí)呛虳-核糖產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線，可以看到，發(fā)酵24 h時(shí)，O2吸收率最大，溶氧達(dá)到最低。且此時(shí)OD590nm達(dá)到最大值的約67%。按照上述標(biāo)準(zhǔn)，選擇24 h作為連續(xù)發(fā)酵的起點(diǎn)，此時(shí)將儲(chǔ)罐中滅過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基通過蠕動(dòng)泵以一定流速連續(xù)流加入發(fā)酵罐，同時(shí)從溢流口以相同的流速連續(xù)溢出發(fā)酵液，轉(zhuǎn)為連續(xù)發(fā)酵。

圖1 分批發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖的一般規(guī)律

2.2 稀釋率對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵的影響

單級(jí)連續(xù)發(fā)酵流加底物糖濃度為200 g/L，通過改變不同稀釋率研究其對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵影響，測(cè)定殘?zhí)菨舛?、菌體生長(zhǎng)量(OD)、D-核糖濃度，并計(jì)算出D-核糖收率，結(jié)果如表l所示?？梢钥闯?，隨著稀釋率增加，發(fā)酵罐中的菌體生長(zhǎng)量(OD)和D-核糖濃度不斷下降，而殘?zhí)菨舛戎饾u升高。此外，隨著底物流加速率提高，D-核糖收率也在不斷下降。

表1 不同稀釋率對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵的影響

根據(jù)表1數(shù)據(jù)計(jì)算出不同稀釋率下的糖消耗速率和D-核糖產(chǎn)率，結(jié)果如圖2所示?？梢钥吹?，糖消耗速率隨稀釋率加大而提高。這主要是因?yàn)橄♂屄瘦^低時(shí)，流加的還原糖在發(fā)酵罐中停留時(shí)間較長(zhǎng)，被菌體利用得較為充分，糖消耗速率較低;在稀釋率較高時(shí)，還原糖在發(fā)酵罐中停留時(shí)間較短，來不及被利用就流出罐外，因此糖消耗速率呈明顯的增加趨勢(shì)。而隨著稀釋率提高，D-核糖產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加而后下降的過程，當(dāng)稀釋率為0.06 h－1時(shí)，D-核糖產(chǎn)率達(dá)到最大的4.07 g/(L·h)。

圖2 稀釋率對(duì)單級(jí)連續(xù)發(fā)酵糖消耗速率和D-核糖產(chǎn)率的影響

綜上，稀釋率對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵的影響較大，當(dāng)稀釋率為 0.06 h－1時(shí)，D-核糖產(chǎn)率最大，可達(dá)4.07 g/(L·h)，為最佳稀釋率。此時(shí)，發(fā)酵罐殘?zhí)菨舛葹?.47%，OD590nm為0.633，D-核糖濃度為67.9 g/L，D-核糖收率 41.0% 。

2.3 流加糖濃度對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵的影響

固定稀釋率為0.06 h－1，改變流加糖初始濃度研究其對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵的影響。測(cè)定殘?zhí)菨舛?、糖利用率、菌體生長(zhǎng)量(OD)和D-核糖濃度，結(jié)果見表2。由表2可見，連續(xù)發(fā)酵過程中，在底物糖流加速度一定的情況下，隨著流加糖濃度提高，發(fā)酵醪液的殘?zhí)菨舛炔粩嘣黾樱抢寐蕝s不斷下降，菌體生長(zhǎng)量(OD)從0.414增大到0.647，其后變化不大。D-核糖濃度則從最初的40.1 g/L增加到流加糖濃度為200 g/L時(shí)的68.7 g/L，糖濃度繼續(xù)增加，D-核糖濃度始終保持在67 g/L左右。

表2 不同流加糖濃度對(duì)對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵的影響

流加糖濃度對(duì)糖消耗速率、D-核糖產(chǎn)率的影響見圖3。隨著流加糖濃度由50 g/L增加到200 g/L，糖消耗速率由2.99 g/(L·h)快速增至11.90 g/(L·h)，此后增加緩慢。D-核糖產(chǎn)率在流加糖濃度為50 g/L時(shí)為2.1 g/(L·h)，200 g/L時(shí)達(dá)到最大的4.12 g/(L·h)，此后略有下降。

圖3 流加糖濃度對(duì)單級(jí)連續(xù)發(fā)酵消耗速率和D-核糖產(chǎn)率的影響

因此，在一定的稀釋率條件下，流加糖濃度對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵影響較大，并且流加糖濃度維持在一定范圍內(nèi)效果較好，繼續(xù)提高流加糖濃度并不會(huì)使D-核糖產(chǎn)率加，反而導(dǎo)致糖利用率降低，造成浪費(fèi)。稀釋率為0.06 h－1時(shí)，最佳的流加糖濃度為200 g/L。

2.4 D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定性研究

單級(jí)連續(xù)發(fā)酵在30L自控發(fā)酵罐中進(jìn)行，發(fā)酵溫度控制在 (35±0.5)℃，罐壓為0.08 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速360 r/min，通氣量為1∶0.5。發(fā)酵罐中初始還原糖濃度為200 g/L，發(fā)酵24 h后開始以0.06 h－1的稀釋率，將儲(chǔ)罐中滅過菌的糖濃度為200 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基通過蠕動(dòng)泵連續(xù)流加入發(fā)酵罐，同時(shí)溢流口以相同的速率連續(xù)溢出發(fā)酵液，連續(xù)發(fā)酵160 h，結(jié)果如圖4所示。

圖4 連續(xù)發(fā)酵160 h各參數(shù)變化曲線

可以看到，D-核糖單級(jí)連續(xù)連續(xù)發(fā)酵約48 h后基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)，此后發(fā)酵醪液中的殘?zhí)菨舛?、溶氧、菌體生長(zhǎng)量(OD)和D-核糖濃度均在一定的范圍內(nèi)波動(dòng)，連續(xù)穩(wěn)定發(fā)酵160 h，效果良好。

3 結(jié)論

(1)發(fā)酵24 h時(shí)，O2吸收率最大，溶氧達(dá)到最低，且此時(shí)菌體達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，因此選擇24 h流加培養(yǎng)基，開始連續(xù)發(fā)酵。

(2)研究了稀釋率、流加糖濃度對(duì)D-核糖單級(jí)連續(xù)發(fā)酵的影響，結(jié)果表明:稀釋率為0.06 h－1，流加糖濃度為200 g/L時(shí)，D-核糖產(chǎn)率達(dá)到最大，可達(dá)4.0 g/(L·h)以上。

(3)以上述條件進(jìn)行D-核糖單級(jí)連續(xù)連續(xù)發(fā)酵，約48 h后基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)，連續(xù)穩(wěn)定發(fā)酵160 h，效果良好。

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