章宏瓊，楊娟，周云，宋佳楠，朱憶思夢，施孟如，張洪勤

（溫州醫(yī)學院，浙江 溫州 325035，1.仁濟學院；2.生物學實驗教學中心）

紅樹植物秋茄ISSR條件的優(yōu)化

章宏瓊1，楊娟1，周云1，宋佳楠1，朱憶思夢1，施孟如2，張洪勤2

（溫州醫(yī)學院，浙江 溫州 325035，1.仁濟學院；2.生物學實驗教學中心）

目的：探討紅樹植物秋茄簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性分子標記（ISSR-PCR）分析的最優(yōu)條件，以獲得清晰、重復性好的簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）擴增結果。方法：對ISSR-PCR多個條件中的單個條件包括DNA的提取、模板濃度、Taq酶的選擇與用量、Mg2+和三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTP）濃度等進行了比較、優(yōu)化。結果：從單條件中得出每個條件的最優(yōu)條件，從而獲得清晰、重復性高的電泳圖譜。結論：秋茄ISSR-PCR分析最適宜的擴增條件為：25μL PCR反應體積中，0.75～1.0 U Taq DNA聚合酶，0.8μmol/L引物，0.2 mmol/L dNTP，2.0～2.5 mmol/L MgCl2，40 ng/μL模板DNA。

紅樹科；秋茄；簡單序列重復區(qū)間；條件優(yōu)化

紅樹林是處于亞熱帶、熱帶海洋與陸地過渡帶的特殊生態(tài)系統(tǒng)，是海岸帶的生態(tài)關鍵區(qū)，具有抵抗海嘯和臺風、調節(jié)區(qū)域氣候、維護生物多樣性等重要生態(tài)功能[1]。秋茄（Kandelia candel）是我國分布最廣的常見紅樹植物，其天然分布最北至福建福鼎市，人工種植最北至寧波象山港，全世界最北分布的紅樹植物也是秋茄[2]。

簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（inter-simple sequence repeat，ISSR）DNA分析由Zietkiewicz等[3]于1994創(chuàng)建，是建立在PCR反應基礎上的一種新的分子生物學技術，它把隨機擴增多態(tài)性DNA分子標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和微衛(wèi)星標記（simple sequence repeat，SSR）的優(yōu)點相結合，不但具有RAPD所需DNA量少、操作簡單、不需預知研究對象的基因組序列等優(yōu)點，而且具有SSR的穩(wěn)定性[4]。因此，ISSR近年來已迅速應用于遺傳多樣性的研究、種質資源研究和品種鑒定，成為構建遺傳圖譜的重要工具之一[5-6]。盡管ISSR擴增技術原理簡單，但由于PCR條件的變化，往往會出現(xiàn)不同的擴增結果，其影響因素主要有：Mg2+的濃度、三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTP）濃度、Tag酶和DNA模板的濃度。

本研究通過對ISSR-PCR實驗條件的優(yōu)化，建立重復性好、結果清晰而穩(wěn)定的秋茄ISSR的實驗參數(shù)，為進一步研究紅樹植物秋茄種群的遺傳變異和規(guī)律奠定良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料的采集與處理 秋茄葉片采自廈門漳江口、溫州西門島和寧波象山港。在選定的三個不同緯度居群中每隔5～10 m選擇長勢良好的植株，采集當年生的展開完全的幼嫩葉片（倒二葉）每樹10片，用棉花蘸取足夠的水分包住莖枝條的基部，為保持葉片新鮮不變質，必須迅速放冰上保存，處理待測，并于-20 ℃冰箱內保存。

1.2 實驗儀器與試劑 BID-RAD Gel Doc凝膠成像分析儀（美國，BIO-RAD公司）；Sartorius BT124S電子分析天平（上海恒剛儀器儀表有限公司）；MILLIPORE F5CN29159超純水制備系統(tǒng)（美國，Millipore公司）；Hybaid Px2PCR梯度擴增儀（Thermo公司）；NanoDrop 2000（Thermo公司）；Taq酶（大連寶生物）；ISSR引物、DNA分子marker（上海捷瑞）；其余瓊脂糖粉末、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等常用試劑均為國產分析純。

1.3 秋茄DNA的提取及檢測 秋茄葉片總DNA采用改良后的CTAB法[7]提?。?% CTAB，0.1 mol/L Tris HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% β-巰基乙醇），獲得的DNA由NanoDrop 2000測定其濃度及純度。根據(jù)基因組DNA濃度值將樣品分別稀釋至10、20、30、40、60 ng/μL用于ISSR-PCR。

1.4 ISSR-PCR反應 PCR擴增體系:反應體系中含10× PCR Buffer（Mg2+free）、dNTP mixture（2.5 mmol/L）、引物（10μmol/ L）、DNA（30～50 ng）、TaKaRa Taq（5 U/μL），最后加ddH2O至25μL，用漩渦混合器對所加的各組分進行混合。擴增程序：94 ℃預變性5 min，之后進行45個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，最后于72 ℃再延伸7 min。將擴增產物置于4 ℃冰箱保存。將PCR擴增產物用1×TAE配制的瓊脂糖凝膠電泳分離，以DNA ladder Marker（100～2000 bp） 作為相對分子質量標準，在恒定電壓下電泳，電泳結束后在電泳凝膠成像系統(tǒng)中觀察記錄擴增產物的泳帶，并保存圖像。

2 結果和討論

2.1 DNA提取 本實驗提取的DNA呈無色絮狀沉淀，電泳顯示該DNA完整，并無明顯降解（見圖1）。將DNA溶液稀釋后用TE緩沖液為空白對照測其在260 nm及280 nm波長的紫外吸收，其紫外吸收比值（A260/280） 為1.89～1.93。結果顯示改良后的CTAB法是一種提取后DNA所含雜質少、提取方法簡單的基因組DNA提取方法。所提取的秋茄DNA由NanoDrop 2000測定其濃度及純度。根據(jù)基因組DNA濃度值將樣品稀釋至特定濃度用于ISSR分析。

圖1 三個居群部分個體的總DNA

2.2 模板DNA濃度 模板DNA濃度是影響ISSR-PCR擴增的主要因素之一。本次實驗對比了6種用于PCR反應的模板DNA濃度（分別為10、20、30、40、50、60 ng/μL）。結果顯示，模板DNA的濃度對ISSR結果有明顯的影響，當模板DNA的濃度為10 ng/μL時條帶不多，而在30～50 ng/μL時均擴增出基本相同的帶型，但當濃度升到至60 ng/μL時擴增的ISSR譜帶反而減少。所以在檢測秋茄遺傳多樣性研究中，我們采用的DNA模板濃度為40 ng/μL。

2.3 引物濃度 引物合適的終濃度可在0.1～1.0 μmol/L之間選擇。在控制其他條件一致時，我們設置了0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L的一系列引物濃度梯度，結果表明，引物濃度太低時（0.2～0.4μmol/L），擴增產物太少甚至無擴增條帶；引物濃度太高時，又容易出現(xiàn)非特異性擴增反應。實驗結果（見圖2）證明，在引物濃度為0.8 μmol/L時條帶最清晰，因此，在秋茄ISSR-PCR實驗中，引物濃度為0.8μmol/L最佳。

圖2 不同模板DNA質量濃度的ISSR擴增結果（引物BW09481HAP）

2.4 Taq酶濃度 在ISSR-PCR的反應體系中，Taq酶的用量會直接導致ISSR-PCR擴增反應的成功與否。當其他反應條件一致時，我們對比設置了0.5、0.75、1.0、1.5 U的梯度Taq酶用量，結果表明，0.5 U酶含量過低，產物的合成效率極低，無擴增產物出現(xiàn)；0.75～1.0 U可以得到重復的清晰條帶，而且無非特異性擴增；而1.5 U酶含量則過大，雖然能夠得到擴增產物，但是出現(xiàn)大量的非特異性擴增，同時擴增產物主帶相連，分離效果低，模糊難以辨認。因此，在秋茄ISSR-PCR實驗中，Taq酶的使用量在0.75～1.0 U范圍內為最佳。

2.5 Mg2+濃度 Mg2+濃度也是ISSR-PCR的一個重要影響因素。Mg2+作為Taq酶的輔助因子，其濃度不僅可以影響反應液中的dNTP、模板DNA及引物結合效率，也會影響Taq酶活性，影響模板與PCR產物的解鏈溫度以及引物二聚體的形成和產物的特異性[8]。本實驗對所采用的每個引物均設置了Mg2+濃度梯度的比較，即1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L。結果表明，在ISSR-PCR反應液中，當Mg2+濃度為1.5 mmol/L時，無擴增產物出現(xiàn)；濃度為2.0～2.5 mmol/L時能得到清晰重復性好的條帶，而且無非特異性擴增；當濃度為3.0～3.5 mmol/L時雖然也能得到擴增條帶，但是條帶變少，而且具有非特異性擴增。所以，Mg2+濃度我們采用2.5或2.0 mmol/L，但是不同的引物對反應系統(tǒng)中的Mg2+濃度要求不同，根據(jù)引物而決定其濃度。在一般的秋茄DNA的PCR反應中，2.0～2.5 mmol/L Mg2+較為合適[9]。

2.6 dNTP濃度 dNTP為ISSR-PCR反應提供原料。為了確定最適合的dNTP量，分別設置0.12、0.16、0.20 mmol/L的dNTP濃度梯度（Mg2+濃度設定為2.0 mmol/L）。結果表明，dNTP濃度為0.20 mmol/L時能得到清晰的條帶，而且沒有非特異性擴增；當dNTPs的濃度過低（低于0.20 mmol/L）時，會出現(xiàn)條帶不清晰或非特異性擴增條帶；當濃度高于0.20 mmol/L時，條帶數(shù)量會急劇減少甚至全部消失，可能是因為dNTP濃度過高會螯和大量Mg2+從而造成Taq DNA聚合酶活性降低，最終導致擴增量減少甚至整個反應失敗[10]。所以我們認為dNTP濃度為0.20 mmol/L是秋茄ISSR的最佳濃度。

影響ISSR結果的因素很多，本次實驗采取單因素方法來優(yōu)化條件，結果顯示每個單因素的優(yōu)化并不能使ISSR-PCR有最好的結果。綜合多個單因素優(yōu)化條件得出紅樹植物秋茄ISSR-PCR分析較適宜的擴增條件是：25μL PCR反應體積中，0.75～1.0 U Taq DNA聚合酶，0.8μmol/L引物，0.2 mmol/L dNTP，2.0～2.5 mmol/L MgCl2，40 ng/μL模板DNA。我們利用此優(yōu)化系統(tǒng)，順利地從9個引物中篩選出擴增條帶清晰、重復性好的4個引物（BW09461HAP、BW09480HAP、BW09481HAP、BW09492HAP）作為正式擴增的引物。結果表明優(yōu)化后的PCR反應體系中秋茄3個居群，24個個體均可擴增出明顯條帶。圖3為選用BW09481HAP引物（CTCTCTCTCTCTCTCTRG），對三個居群的24個個體進行ISSR-PCR擴增，得到清晰、多態(tài)性高的ISSR帶譜，并具有較好的重復性。而圖4為引物BW09497HAP對24個個體的ISSR-PCR擴增結果，對比可見圖4的ISSR帶譜沒有圖3清晰、重復性好，由此可知：只有進行了PCR條件的優(yōu)化才能進行引物的篩選，篩選出適合該物種的引物，進行下一步研究。

圖3 優(yōu)化的ISSR-PCR系統(tǒng)對三個居群（寧波、溫州、廈門）24個體擴增的ISSR帶型（引物BW09481HAP）

圖4 優(yōu)化的ISSR-PCR系統(tǒng)對三個居群（寧波、溫州、廈門）24個體擴增的ISSR帶型（引物BW09497HAP）

綜上所述，本研究優(yōu)化了秋茄植物ISSR的反應體系和程序，并篩選出適宜秋茄種質資源分子鑒定的ISSR引物，這將為更好地利用秋茄種植資源進行育種及相關研究提供幫助。

[1] Nagelkerken I, Blaber SJM, Bouillon S, et al. The habitat function of mangroves for terrestrial and marine fauna:A review[J]. Aquatic Botany, 2008, 89(2):155-185.

[2] 仇建標, 黃麗, 陳少波, 等. 強潮差海域秋茄生長的宜林臨界線[J]. 應用生態(tài)學報, 2010, 21(5):1252-1257.

[3] Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR) -anhored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics, 1994, 20(2):176-183.

[4] 何予卿, 張宇, 孫梅, 等. 利用ISSR分子標記研究栽培稻和野生稻親緣關系[J]. 農業(yè)生物技術學報, 2001, 9(2):123-127.

[5] Gilbert JE, Lewis RV, Wilkinson MJ, et al. Developing an appropriate strategy to assess genetic variability in plant germplasm collections[J].Theor Appl Genet, 1999, 98(6-7):1125-1131.

[6] Bornet B, Goraguer F, Joly G, et al. Genetic diversity in European and Argentinian cultivated potatoes (Solanum tuberosum subsp.tuberosum) detected by intersimple sequence repeats(ISSRs)[J]. Genome, 2002, 45(3):481-484.

[7] Rogers OS, Bendich AJ. Extraction of DNA plant tissue,plant molecular[M]. Gelvin SB, Schilpe RA, Verna DS. Plant molecular biology manual. Dordecht:Kluwer Academic Publishiers,1988:1-10.

[8] 林萬明. PCR技術操作和應用指南[M]. 北京:人民軍醫(yī)出版社, 1993:7-14.

[9] 盧圣棟. 現(xiàn)代分子生物學實驗技術[M]. 2 版.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社, 1999.

[10] 文曉鵬, 鄧秀新. 刺梨及其近緣種PCR實驗體系的建立與優(yōu)化[J]. 果樹學報, 2003, 20(1):35-39.

Q503

B

1000-2138（2012）06-0566-03

2012-05-14

章宏瓊（1990-），女，浙江三門人，本科生。現(xiàn)工作單位為臺州市三門縣恒康制藥有限公司。

張洪勤，高級實驗師，Email：zh429@126.com。

丁敏嬌）

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