蘇旻罡 劉志國 夏鐵成 郝建學(xué) 張建鵬
脊柱融合術(shù)是脊柱外科的基本手術(shù)之一,后外側(cè)橫突間、小關(guān)節(jié)突間融合是目前常用的方法,但假關(guān)節(jié)發(fā)生率較高,據(jù)報道為20% ~50%[1]。自體骨髓內(nèi)含有骨髓基質(zhì)干細胞,具有成骨能力。本實驗通過研究自體骨髓在腰椎橫突間融合中誘導(dǎo)成骨的作用,探討其作為骨移植添加物的效果,為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。
1.1 動物分組與手術(shù) 健康、骨骼成熟中國白兔24只(由河北大學(xué)附屬醫(yī)院實驗中心提供,清潔級動物,普通環(huán)境、單籠喂養(yǎng),飼喂質(zhì)量合格的全價飼料),雌雄不限,體重3~3.5 kg,隨機分為實驗組(14只)和對照組(10只)。腹腔內(nèi)注射硫賁妥鈉(30 mg/kg),如麻醉效果差,加用0.5%普魯卡因局部浸潤。腰5、6棘突為中心做后正中切口,自椎旁肌外側(cè)向前分離肌肉,顯露雙側(cè)5、6腰椎橫突,去除后方骨皮質(zhì),取一側(cè)髂骨約1 g修剪成約0.3 cm3骨塊,每側(cè)橫突間植入約0.5 g。實驗組從另一側(cè)髂骨一點穿刺抽取2 ml骨髓,抽吸前注射器內(nèi)取0.1 ml肝素鈉液,2 ml與髂骨塊充分混勻放置數(shù)分鐘,每側(cè)融合區(qū)各植入0.5 g自體髂骨和1 ml自體骨髓的混合物。術(shù)后單籠喂養(yǎng),未用外固定。術(shù)后4周每組各處死2只動物,8、12周,實驗組和對照組每批分別處死6、4只動物。脊柱標(biāo)本立即放入4℃、10%甲醛固定3~4 d。
1.2 觀察指標(biāo) 組織學(xué)觀察:將所有4、8、12周標(biāo)本制成組織切片,再經(jīng)過HE染色后觀察各時期融合骨塊生長情況,具體步驟:將固定好的標(biāo)本去除附帶的肌肉組織,放入8%甲酸液中脫鈣,直至針刺椎體見其變軟。取出標(biāo)本,清水沖洗干凈,將融合區(qū)切下,切成3×2×0.4 cm3小塊。將標(biāo)本編號后放入脫水盒中,室溫下經(jīng)不同濃度乙醇各脫水、氯仿透明、浸蠟包埋、切片。然后經(jīng)過烤片、脫蠟。最后經(jīng)HE染色、組織學(xué)觀察分析。
2.1 實驗組 4周時見大量新生骨小梁,內(nèi)有較成熟骨髓組織(圖1)。8周時成熟骨小梁明顯增多,成骨細胞能力明顯降低。成熟骨小梁表面破骨細胞數(shù)量多,進入塑形改造階段(圖2)。12周時,新生骨小梁罕見,可見大量板層骨,表面的成骨細胞明顯減少,可見成熟骨髓組織,表面塑形改造已經(jīng)完成(圖3)。
2.2 對照組 新生骨小梁少,發(fā)育相對滯后。移植骨被纖維組織和破骨細胞包圍,表明移植骨被吸收(圖4)。8周時新生、成熟骨小梁均可見到,新生骨小梁較多,成骨細胞能力弱,成熟骨小梁明顯少于同時期的實驗組(圖5)。12周時,成熟骨小梁數(shù)量明顯少于實驗組。成骨細胞數(shù)目較8周時明顯減少,成骨能力明顯減弱(圖6)。
2.3 2組比較 各時期實驗組成骨方式始終以膜內(nèi)成骨為主,軟骨成骨為輔,對照組則相反。
圖1 實驗組4周標(biāo)本切片可見:大量新生骨小梁(粉染),內(nèi)有大量骨細胞(紫染),可見骨髓組織(HE×100)
圖2 實驗組8周標(biāo)本切片可見:成熟骨小梁明顯增多(粉染),成骨細胞的能力明顯降低,可見較多的破骨細胞(紫染),表明新生骨已經(jīng)進入塑形改造階段,可見成熟的骨髓組織(HE×100)
圖3 實驗組12周標(biāo)本切片可見:新生骨小梁罕見,可見大量板層骨,表面的成骨細胞明顯減少,內(nèi)有成熟骨髓組織,新生骨塑形改造已經(jīng)完成(HE×400)
圖4 對照組4周標(biāo)本切片可見新生骨小梁少,發(fā)育相對滯后,移植骨被纖維組織和破骨細胞包圍,表明移植骨被吸收(HE×100)
圖5 對照組8周標(biāo)本切片可見:新生、較成熟骨小梁均存在,新生骨小梁較多,成骨細胞能力弱,成熟骨小梁明顯少于同時期的實驗組(HE×100)
圖6 對照組12周標(biāo)本切片可見:成熟骨小梁數(shù)量明顯少于實驗組(HE×400)
自體髂骨是較理想的骨移植物,具有成骨所需要的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)作用,但其來源有限,特別對于假關(guān)節(jié)形成需二次手術(shù)、需多節(jié)段融合及小兒脊柱側(cè)彎矯形的患者。而且,取骨區(qū)并發(fā)癥較多,發(fā)生率6%~25%。目前,有多種骨移植材料用于脊柱融合,然而其費用昂貴并可能形成異位骨化,而且某些臨床實驗性應(yīng)用顯示其效果等同于自體髂骨移植。近些年,同種異體骨融合效果日益提高[1],但仍然存在交叉感染疾病、免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險。而且,Butterman等[2]發(fā)現(xiàn),胸腰椎后路融合應(yīng)該使用自體髂骨移植。目前研究較多的骨髓基質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)擴增后,復(fù)合載體用于脊柱融合,成骨作用強,融合率高[2]。但目前僅限于實驗研究,而且對技術(shù)設(shè)備要求高,只能手術(shù)植入,不能經(jīng)皮注射。
自體骨髓內(nèi)的紅骨髓含有造血細胞和骨髓基質(zhì),骨髓基質(zhì)中含多能干細胞,Owen[3]稱之為骨髓基質(zhì)干細胞,其可以在無誘導(dǎo)下骨化,稱為確定性骨源性前體細胞(determined osteogenic precursor cells,DOPC),也稱為骨源性干細胞(osteogenic stem cells)。Turksen等[4]證明,DOPC體外培養(yǎng)逐步分化成骨源性干細胞→骨祖細胞→前成骨細胞→成骨細胞→骨細胞。
目前,國內(nèi)外許多學(xué)者報道了臨床應(yīng)用自體骨髓移植治療骨折延遲愈合、不愈合、骨缺損和骨囊腫,涉及到脛骨、股骨、肱骨、手舟骨等,效果較好[5-8]。
本實驗組織學(xué)評估可見,各個時期中實驗組骨小梁數(shù)量、成熟度、形成時間均明顯優(yōu)于對照組。因此本實驗組可以證實,自體骨髓在兔腰椎橫突間融合模型中,是一種有效可靠的骨移植添加物,可以減少自體髂骨的用量,但融合效果優(yōu)于單純應(yīng)用自體髂骨移植。主要表現(xiàn)為融合時間較短、成骨量較多、融合牢固。自體骨髓來源充足,獲取方便,而且可以反復(fù)獲取,治療費用低,無傳染疾病、免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險,供骨區(qū)并發(fā)癥較少。是有效、安全、經(jīng)濟的移植添加物。
1 Friedlander GE,Clayton RP,Cole DJ,et al.Osteogenic Protein-1(BMP-7)in the treatment of tibial nonunions.JBJS(Am),2001,83:151-158.
2 Butterman GR,Glazer PA,Bradford DS.The use of bone allografts in the spine.Clin Orthop,1996,324:75.
3 Owen ME.Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system.In:Peck WA,eds.Bone and Mineral Research.Amsterdam:Elsevier,1984.1-25.
4 Turksen K,Aubin JE.Positive and negative immunoselection for enrichment of tow classes of osteoprogenitor cells.J Cell Biol,1991,114:373-384.
5 梁雨田,張伯勛,盧世壁.經(jīng)皮自體骨髓移植在骨缺損瘢痕組織內(nèi)成骨作用的實驗研究與臨床應(yīng)用.中國修復(fù)重建外科雜志,1999,13:148-151.
6 王恒冰,王繼孟,郭宗遠.自體骨髓移植治療小兒孤立性骨囊腫的初步觀察.中華小兒外科雜志,2002,23:68.
7 徐耀增,王曉東,董天華.自體骨髓經(jīng)皮注射治療骨延遲愈合和骨不連.中國矯形外科雜志,2003,11:584-586.
8 Connolly JF,Guse R,Tiedeman J,et al.Autologous marrow injection as a substitute for operative grafting of tibal nonunious.Clin Orthop,1991,266:259-270.