尚素霜 程佳 張靜 任月環(huán) 張利玲 于華 霍艷

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，目前其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。由于卵巢的解剖位置隱蔽，卵巢癌具有發(fā)現(xiàn)晚、轉(zhuǎn)移早等特點(diǎn)。所以如何控制卵巢癌的血管生成和轉(zhuǎn)移就成為治療卵巢癌、提高患者生存率的關(guān)鍵。目前晚期卵巢癌患者施行理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)較為困難，因此化療對(duì)于卵巢癌治療的成敗具有決定性作用。但因?yàn)楂@得性耐藥約占70%～80%，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物(尤其是鉑類(lèi))產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致卵巢癌綜合治療失敗的關(guān)鍵因素。目前對(duì)卵巢癌耐藥機(jī)制研究的焦點(diǎn)已逐漸集中到細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)58例卵巢上皮癌中人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(Topo-Ⅱα)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)組織中的表達(dá)、相互關(guān)系及臨床意義，為卵巢癌有效治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 選擇2008年10月至2009年12月我院住院患者手術(shù)標(biāo)本存檔的88份蠟塊，其中正常卵巢組織10份(對(duì)照組)，卵巢良性上皮腫瘤組織20份(良性組)，卵巢上皮癌組織58份(卵巢癌組)。對(duì)照組患者年齡30～58歲，中位年齡44歲;良性組患者年齡18～50歲，中位年齡37歲;卵巢癌組患者年齡35～73歲，中位年齡56歲。3組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。卵巢癌組病理分級(jí):高、中分化33例，低分化25例;手術(shù)病理分期按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，1988年)的標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期36例;漿液性42例，黏液性16例。所有患者均為初發(fā)，術(shù)前均未接受過(guò)放、化療。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人HER-2單克隆抗體(工作濃度1∶50)，鼠抗人TOPO-Ⅱα單克隆抗體(工作濃度1∶50)，均購(gòu)自Santa Cruz公司。兔抗人PI3K單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供。過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素標(biāo)記盒(SP)試劑盒、DAB顯色劑等均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色方法及結(jié)果判定 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接(SP)法對(duì)HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。每批染色均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照取已知HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌組織的石蠟切片。本實(shí)驗(yàn)染色判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例計(jì)分:光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)算方法為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取其平均值。①1分:陽(yáng)性細(xì)胞比例≤10%;②2分:陽(yáng)性細(xì)胞比例為10% ～50%;③3分:陽(yáng)性細(xì)胞比例為50% ～75%;④4分:陽(yáng)性細(xì)胞比例≥75%。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分:0分:細(xì)胞無(wú)顯色;1分:淺黃色;2分:棕黃色;3分:黃褐色。陽(yáng)性細(xì)胞比例與細(xì)胞染色強(qiáng)度積分的乘積為每例標(biāo)本的最終積分，范圍為0～12分，其中0分為(－)，1～4分(﹢)，5～8分為(﹢﹢)，9～12分為(﹢﹢﹢)。陽(yáng)性表達(dá)率的計(jì)算方法為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系分別采用χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組卵巢組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達(dá) 卵巢上皮癌組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于卵巢正常組織和良性組織(P＜0.05)，卵巢良性組織與正常組織間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達(dá)與卵巢上皮癌手術(shù)病理分期、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、病理類(lèi)型無(wú)關(guān)(P ＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K在卵巢上皮癌中表達(dá)的相關(guān)性 HER-2和TOPO-Ⅱα蛋白陽(yáng)性表達(dá)之間呈正相關(guān)(rs=0.455，P=0.000);HER-2和PI3K蛋白陽(yáng)性表達(dá)之間呈正相關(guān)(rs=0.285，P=0.285);TOPO-Ⅱα 和 PI3K 蛋白陽(yáng)性表達(dá)之間呈正相關(guān)(rs=0.311，P=0.017)。見(jiàn)表3。

表1 卵巢組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達(dá) 例(%)

表2 卵巢組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K表達(dá)的相關(guān)因素 例(%)

表3 卵巢組織中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討論

原癌基因與細(xì)胞的正常生命活動(dòng)密切相關(guān)，發(fā)生突變后導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化平衡的失調(diào)。癌基因活化、抑癌基因缺失在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起主導(dǎo)作用。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體，定位于細(xì)胞膜，編碼分子量170kD的跨膜糖蛋白，廣泛分布于哺乳動(dòng)物除血管外的上皮細(xì)胞膜上［1］。EGFR家族還包括 c-erbB-2、c-erbB-3 和 c-erbB-4［2］。C-erbB2 是人類(lèi)腫瘤常發(fā)生改變的一個(gè)癌基因，HER-2在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中占重要地位，可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，引發(fā)一連串“瀑布”式反應(yīng)，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移和黏附。大量研究表明，HER-2在許多腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等中擴(kuò)增或者過(guò)表達(dá)。Trastuzumab-C-erbB2人源化單克隆抗體已成功用于治療C-erbB2過(guò)度表達(dá)的晚期乳腺癌患者。人源性抗HER-2單克隆抗體Herceptin(赫賽汀)，可與HER-2的胞外位點(diǎn)相結(jié)合，抑制HER-2過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。目前，Herceptin聯(lián)合紫杉醇及其他藥物治療卵巢癌的實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。PIK3A 43.2%，p-AKT 51.6%。結(jié)果表明，HER-1、HER-2 在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起一定的作用并可作為該疾病預(yù)后的特異性指標(biāo)。因此HER-2不但可作為反映惡性腫瘤惡性生物學(xué)特性的指標(biāo)，而且為治療腫瘤提出了新的理念及可能的相關(guān)治療方法。

本研究結(jié)果顯示:HER-2在卵巢上皮癌的陽(yáng)性表達(dá)率為46.6%，而在正常卵巢組織及良性卵巢上皮腫瘤的表達(dá)率較低，惡性組與良性組及對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而良性組與對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，提示HER-2在卵巢上皮癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用;臨床期別越晚，HER-2蛋白表達(dá)率也越高，Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為27.3%、58.3%，2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明HER-2的表達(dá)與臨床分期有關(guān);研究顯示腫瘤分化程度越差，HER-2的陽(yáng)性表達(dá)率也越高，表明HER-2的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P＜0.05);對(duì)不同年齡階段及不同組織學(xué)類(lèi)型HER-2的表達(dá)情況進(jìn)行分析后結(jié)果表明HER-2的表達(dá)與年齡和組織學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)。

TOPO-Ⅱ又稱(chēng)旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，有兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基。α亞基具有磷酸二酯酶活性，β亞基具有DNA依賴(lài)的ATP酶活性。TOPO-Ⅱα是DNA復(fù)制的重要核酶，與惡性腫瘤的增生及化療耐藥密切相關(guān)。研究表明，在多種惡性腫瘤中Topo II α的表達(dá)水平增高是一個(gè)普遍現(xiàn)象，而且臨床方面已逐漸將TOPO-Ⅱα作為一個(gè)標(biāo)志，以判斷細(xì)胞或腫瘤的增殖程度［3，4］。Falck等［5］研究TOPO-Ⅱα等基因在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)情況，免疫組化方法顯示41例漿液性卵巢癌組織TOPO-Ⅱα的陽(yáng)性率在30.2% ～59.7%，卡方檢驗(yàn)顯示TOPO-Ⅱα與臨床分期(P=0.0034)，組織分化程度(P=0.0076)及預(yù)后(P=0.0011)均有關(guān)。

TOPO-Ⅱ抑制劑是一類(lèi)以TOPO-Ⅱ?yàn)榘悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物，以拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶點(diǎn)，選擇性抑制增殖期DNA復(fù)制細(xì)胞，集中殺傷腫瘤細(xì)胞。Topo-Ⅱα表達(dá)降低使腫瘤細(xì)胞對(duì)多種抗癌藥產(chǎn)生耐藥，Topo-Ⅱα含量的高低，可以作為判定各種腫瘤對(duì)抗癌藥物的敏感性或抗藥性的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TOPO-Ⅱα在卵巢上皮癌的陽(yáng)性表達(dá)率為53.4%，而在良性卵巢組織及正常卵巢組織的表達(dá)率較低，與良性組、對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而良性組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反映了TOPO-Ⅱα與腫瘤細(xì)胞的增殖程度有關(guān)。研究結(jié)果還顯示，TOPO-Ⅱα的表達(dá)與組織分化和臨床分期顯著相關(guān)，在高分化，中低分化卵巢上皮癌組織中TOPO-Ⅱα的陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.4%、76.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，TOPO-Ⅱα在臨床分期Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為31.8%、66.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這說(shuō)明腫瘤細(xì)胞的分化越差，臨床分期越晚，TOPO-Ⅱα的陽(yáng)性表達(dá)率越高，提示腫瘤的的預(yù)后不良并表明腫瘤細(xì)胞的增殖程度很高。TOPO-Ⅱα在卵巢上皮癌組織中的表達(dá)與年齡和組織類(lèi)型無(wú)關(guān)。

PI3K是二聚體，主要由一個(gè)催化亞基p110和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基p85組成。它是生長(zhǎng)因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵分子，在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞生存等機(jī)制中具有重要作用［6］。PI3K/Akt是與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一［7］。IA型PI3K是酪氨酸激酶受體(如HER2)傳遞信號(hào)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)子［8］。細(xì)胞膜HER2受生長(zhǎng)因子等刺激后，細(xì)胞內(nèi)PI3K活化，進(jìn)而磷酸化其底物PIP2使其轉(zhuǎn)化為 PIP3［9］。Akt(蛋白激酶 B，PKB)和 PIP3結(jié)合，前者的Thr308和Ser474位點(diǎn)因磷酸化而被激活［10］，活化的Akt可能進(jìn)一步激活其下游分子mTOR等［11］。Ning等［12］在所培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和 A2780/CP70中加入PI3K抑制劑LY294002，可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并引起細(xì)胞周期停滯。有研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可以下調(diào)卵巢癌細(xì)胞株中的AKT磷酸化和活性，PI3K活性抑制劑可以明顯提高順鉑對(duì)耐藥細(xì)胞株誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡效應(yīng)，提示耐藥株對(duì)順鉑的化療抵抗至少一定程度上是源于PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活［9］。

本研究顯示PI3K蛋白在正常卵巢組織細(xì)胞和卵巢良性腫瘤組織中呈現(xiàn)不表達(dá)或弱表達(dá)，而在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)，且主要定位于胞核中。卵巢癌分化越差PI3K蛋白表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)(P＜0.05);臨床分期越晚，PI3K陽(yáng)性表達(dá)率也越高(P＜0.05)。提示PI3K在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

HER-2/neu能夠發(fā)生自身激活，通過(guò)PI3K/Akt通路，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。TOPO-Ⅱα基因與HER-2基因均定位于染色體17q12-q21，C-erbB-2表達(dá)增高還可激活Ras-MAPK或PI3-K等信號(hào)傳導(dǎo)因子，促進(jìn)增殖，間接促進(jìn)TOPO-Ⅱα表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn)，Akt的磷酸化水平從正常乳腺上皮組織、不典型增生到惡性轉(zhuǎn)化，再到腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移漸次增加，且與HER2的過(guò)表達(dá)呈正相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中PI3K催化亞單位(P110)的擴(kuò)增和AKT的變異。在不同類(lèi)型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)此信號(hào)通路的失調(diào)控表達(dá)，系列研究表明PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的關(guān)鍵調(diào)控因素。HER-2，TOPO-Ⅱα，PI3K在多種惡性腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、胃癌等均有共同的過(guò)度表達(dá)并且具有相關(guān)性，提示在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及化療耐藥過(guò)程中可能起協(xié)同作用，并為治療卵巢癌提供新的理念。

本研究結(jié)果顯示卵巢上皮癌中HER-2分別與TOPO-Ⅱα、PI3K的表達(dá)之間均呈正相關(guān)(P ＜0.05)，TOPO-Ⅱα與PI3K的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。提示三者協(xié)同促進(jìn)卵巢上皮癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，對(duì)臨床治療及預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法，檢測(cè)HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K在卵巢上皮癌表達(dá)情況并對(duì)其臨床意義進(jìn)行分析，提示HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K對(duì)促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起重要作用，并與患者預(yù)后有關(guān)。原癌基因HER-2是近幾年來(lái)防治腫瘤的一個(gè)重要靶點(diǎn)，TOPO-Ⅱα抑制劑是目前卵巢上皮癌化療的常用藥物，PI3K/AKT在惡性腫瘤發(fā)生，增殖，轉(zhuǎn)移，血管生成及化學(xué)耐藥中的作用，以該通路為靶點(diǎn)的特異性或非特異性抑制劑在腫瘤治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。因此研究三者之間的關(guān)系將會(huì)進(jìn)一步加深對(duì)卵巢癌發(fā)病機(jī)制的理解，并為卵巢癌有效治療提供新思路。

1 Paul W，Sholam B，Matthew R，et al.Correlation of the structure of the transmembrane domain of the neu oncogene-encoded p185 protein with its function.Biochemistry，1990，87:8660-8664.

2 William J.Update on HER-2 as a target for cancer tHerapy:Alternative strategies for targeting the epidermal growth factor system in cancer.Breast Cancer Res，2001，3:390-394.

3 Lazar E，Tudose N，Lazar DC.Prognostic significance of c-erbB2 protein in endometrial cancer.Rom J Morphol Embryol，1998，44:101-107.

4 Suzuki C，Matsumoto T，Sonoue H，et al.Prognostic significance of the infiltrative pattern invasion in endometrioid adenocarcinoma of the endometrium.Pathol Int，2003，53:495-500.

5 Falck J，Jensen PB，Sehested M.Evidence for repressional role of an inverted CCAAT box in cell cycle-dependent transcription of the human DNA topoisomerase IIalpha gene.J Biol Chem，1999，274:18753-18758.

6 Cantley LC.The phosphoinositide 3-kinase pathway.Science，2002，296:1655-1657.

7 Xu G，ZhangW，Bertram P，et al.Pharmacogenomic profiling of the PI3K/PTEN-AKT-mTOR pathway in common human tumors.Int J Oncol，2004，24:893-900.

8 Vivanco I，Sawyers CL.Pharmacogenomic profiling of the PI3K/PTENAKT-mTOR pathway in common human tumors.Nat Rev Cancer，2002，2:489-501.

9 Pene F，Claessens YE，Muller O，et al.Role of the phosphatidylinosi tol 3-kinase/Akt and mTOR/P70S6-kinase pathways in the proliferation and apoptosis in multiple myeloma.Oncogene，2002，21:6587-6597.

10 Hill MM，Hemmings BA.Inhibition of protein kinase B/Aktimplications for cancer therapy.Phamacol Ther，2002，93:243-251.

11 Huang S，Houghton PJ.Targetiog mTOR signaling for cancertherapy.Curr Opin Pharmacol，2003，3:371-377.

12 Ning G，Daniel C，F(xiàn)lynn L，et al.G1 cell cycle progression and the expression of G1 cyclins are regulated by PI3K/AKT/mTOR/p70S6K1 signaling in human ovarian cancer cells.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287:281-291.