新型結(jié)核病疫苗的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢

吳雪瓊

目前結(jié)核病依然是全球感染性疾病的第一“殺手”，Mtb耐藥問題越來越嚴(yán)重，艾滋病、移民和貧困等社會問題使得結(jié)核病在一些發(fā)達(dá)國家開始回升。我國的結(jié)核病疫情和耐藥情況都較嚴(yán)重，2011年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14.3%，位居全球第2位。結(jié)核病疫情未能獲得控制，究其根本原因是缺乏有效的疫苗預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生。新型結(jié)核病疫苗的研究已成為國內(nèi)外結(jié)核病研究的熱點之一，比爾·蓋茨專門成立全球結(jié)核病疫苗基金會（Aeras Global TB Vaccine Foudation，簡稱AERAS）；我國重大傳染病專項均支持結(jié)核疫苗的研究。根據(jù)疫苗的用途可將其分為兩類：一是預(yù)防性疫苗，主要應(yīng)用于新生兒和未感染的正常人群，保護(hù)其不被Mtb感染；二是治療性疫苗，主要應(yīng)用于己感染Mtb的無癥狀攜帶者，使其不發(fā)病，或用于己發(fā)病的患者，促進(jìn)其早日痊愈。

一、卡介苗的預(yù)防效果

卡介苗（BCG）是牛結(jié)核分枝桿菌的減毒活疫苗，自1928年BCG用于人類以來，已在世界各地廣泛應(yīng)用，已證明其是世界上最安全的疫苗之一，其免疫原性約持續(xù)10年，可有效地預(yù)防嚴(yán)重的結(jié)核病（如播散型結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎），保護(hù)效力為65%～95%（平均86%），但不能預(yù)防Mtb的感染，對肺結(jié)核的保護(hù)效力是0%～80%，差異很大。究其原因可能受下列因素的影響：（1）BCG菌株差異：在凍干技術(shù)發(fā)明前，通過培養(yǎng)傳代和保存使當(dāng)年預(yù)防肺結(jié)核非常有效的BCG菌株已不復(fù)存在。目前世界各國使用的BCG菌株之間差異極大，BCG缺失了129個基因閱讀框架，缺失了一些毒力因子（如ESAT 6），也丟失了一些免疫保護(hù)基因，如一些能夠誘導(dǎo)有意義的T細(xì)胞應(yīng)答的休眠期抗原的缺失。（2）環(huán)境分枝桿菌的感染：雖產(chǎn)生一定程度的免疫保護(hù)效力，但也減弱了BCG的免疫保護(hù)作用。（3）Mtb感染菌株差異：不同地區(qū)人群感染的Mtb菌株在毒力、基因、蛋白表達(dá)等方面的差異，也會影響對BCG的免疫反應(yīng)。（4）Mtb內(nèi)源性復(fù)燃或外源性再感染：BCG不能預(yù)防Mtb內(nèi)源性的復(fù)燃和外源性的再感染。（5）接種人群的差異：人群的遺傳背景不同導(dǎo)致對BCG免疫反應(yīng)的差異。（6）臨床試驗方法的差異：不同國家和地區(qū)進(jìn)行的臨床試驗在實施方法、評價指標(biāo)等方面也不完全一致，影響效果的評價。此外，對于免疫功能缺陷者，BCG接種可能導(dǎo)致全身播散。江西省胸科醫(yī)院開展BCG免疫治療的研究，目前尚有爭議。因此，BCG不能預(yù)防肺結(jié)核的發(fā)生，研制新型更有效的疫苗替代BCG或加強(qiáng)BCG的效力勢在必行。

二、新型結(jié)核病疫苗的研究策略

理想的結(jié)核病疫苗需具備下列條件：具有強(qiáng)的保護(hù)效力，只需免疫1次或少數(shù)幾次即可預(yù)防Mtb感染和結(jié)核病發(fā)生；免疫原性穩(wěn)定、持久；不良反應(yīng)少；價廉；與其他疫苗相互間無干擾。分子生物學(xué)和免疫學(xué)的進(jìn)步促進(jìn)了結(jié)核新疫苗的發(fā)展，目前主要有以下幾種研究策略：（1）取代BCG的初種疫苗（priming vaccine）：是一種優(yōu)于BCG、具有更長久免疫保護(hù)效果的新疫苗，目前只有新型的重組分枝桿菌菌苗才有可能取代BCG。（2）增強(qiáng)BCG效果的加強(qiáng)疫苗（late booster vaccine）：目前主要研究亞單位疫苗（如重組蛋白疫苗、DNA疫苗）、以病毒為載體的疫苗，以增強(qiáng)、延長BCG初免的保護(hù)效果。（3）用于結(jié)核感染者的多相疫苗（postexposure multiphase vaccine）：既是一種預(yù)防性疫苗，又是一種治療性疫苗，主要用于預(yù)防內(nèi)源性復(fù)燃和外源性再感染。因此，該疫苗的設(shè)計需包含Mtb在急性感染期和潛伏期表達(dá)的兩類免疫顯性抗原。（4）用于結(jié)核病患者的治療性疫苗（therapeutic vaccine）：目前主要研究亞單位疫苗與化療聯(lián)合應(yīng)用，以促進(jìn)痰菌陰轉(zhuǎn)、病灶減少、空洞閉合，期望能夠達(dá)到縮短療程的目的。

三、新型結(jié)核病疫苗的研究

目前，結(jié)核病疫苗研究的種類主要有下列3種：活疫苗、亞單位疫苗和滅活疫苗。活疫苗包括基因重組活疫苗和減毒活疫苗，對Mtb或BCG進(jìn)行改良以減少前者的致病力或提高后者的免疫保護(hù)效力。主要包括表達(dá)分枝桿菌T細(xì)胞抗原的重組活疫苗、表達(dá)細(xì)胞因子的重組BCG、Mtb營養(yǎng)缺陷型突變株、Mtb減毒活疫苗或其他的弱毒或無毒分枝桿菌活菌苗（如母牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、微小分枝桿菌），其研制的關(guān)鍵在于免疫原性和安全性，希望獲得替代BCG的初種疫苗。亞單位疫苗只用Mtb的一部分成分引起機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，主要包括DNA疫苗、重組蛋白疫苗或多肽疫苗（加佐劑）、多肽以外的其他純化的主要成分（如枝菌酸、糖脂，等等），它可作為BCG的加強(qiáng)疫苗或治療性疫苗。滅活疫苗（如母牛分枝桿菌、草分枝桿菌菌苗）只能引起短暫的免疫反應(yīng)，不能像活的Mtb那樣刺激機(jī)體產(chǎn)生具有免疫保護(hù)性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而不能產(chǎn)生持久、有效的免疫保護(hù)力，主要作為治療性疫苗。

1.重組活疫苗：表達(dá)分枝桿菌抗原的重組活疫苗是利用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)敕种U菌（如BCG、恥垢分枝桿菌、母牛分枝桿菌等）或其他活細(xì)菌［如李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門菌］、活病毒（如牛痘苗病毒、腺病毒或仙臺病毒等）中，依靠細(xì)菌、病毒在宿主內(nèi)的復(fù)制，表達(dá)外源抗原，以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫；表達(dá)細(xì)胞因子如［IFN－γ、IL－2、粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM－CSF）、IL－18］的重組BCG的免疫原性增強(qiáng)。這些基因工程菌苗不僅同時具備佐劑和載體功能，又具有多種外源抗原與活疫苗的作用，一次接種可獲得強(qiáng)而持久的特異性免疫。

BCG是目前所知最強(qiáng)的免疫佐劑之一，具有持久的非特異免疫刺激作用，而且安全、成本低、穩(wěn)定，以BCG作為工程菌的疫苗具有許多優(yōu)點。德國柏林 Max－Planck研究所研制的rBCG：：ΔureC－h(huán)ly疫苗VPM－1002，是表達(dá)李斯特菌的膜打孔李斯特菌素（Hly）而自身尿素酶C缺乏的重組BCG，Hly可促進(jìn)抗原進(jìn)入感染靶細(xì)胞的細(xì)胞漿，加強(qiáng)抗原特異性CD4＋和CD8＋T細(xì)胞的產(chǎn)生。在小鼠模型中抗Mtb的保護(hù)效力比BCG強(qiáng)，并可誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗Mtb“北京”株的作用。在重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的小鼠中顯示毒力較BCG弱，具有很好的安全性，2011年在南非進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗［1］。目前通過刪除sec A2和nuoG構(gòu)建了r BCG：：ΔureC－h(huán)ly＋＋Δsec A2和rBCG：：ΔureC－h(huán)ly＋ΔnuoG，增強(qiáng)了CD8＋和Th17 T細(xì)胞應(yīng)答，提高了保護(hù)效力；通過刪除pdx H 構(gòu)建了rBCG：：ΔureC－h(huán)ly＋Δpdx H 營養(yǎng)缺陷株，進(jìn)一步改進(jìn)了安全性。美國加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校醫(yī)學(xué)院研制的r BCG30疫苗，是一種過量表達(dá)Mtb Ag85B抗原的重組BCG，可誘導(dǎo)強(qiáng)的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的保護(hù)效率也比BCG強(qiáng)，已完成Ⅰ期臨床實驗［2］。武漢生物制品研究所目前正在引進(jìn)AERAS－422，是一種過量表達(dá) Mtb Ag85A、Ag85B和Rv3407的重組BCG，該疫苗目前在美國已完成Ⅰ期臨床試驗［3］。復(fù)旦大學(xué)、四川大學(xué)、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院和解放軍第三〇九醫(yī)院研究的多種類型的重組BCG，第四軍醫(yī)大學(xué)研究的過表達(dá)Ag85B和ESAT6重組恥垢分枝桿菌菌苗尚處于臨床前研究階段。

英國牛津大學(xué)研制的 MVA－85A（AERAS－485）疫苗，是一種過表達(dá) Mtb Ag85A的重組牛痘安卡拉病毒疫苗，動物模型及Ⅰ期臨床試驗均顯示具有很好的免疫原性和保護(hù)性，用于人是安全的，目前正在岡比亞和南非進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗［4］。AERAS和歐洲Crucell NV生物技術(shù)公司聯(lián)合研制的 Ad35－85B－TB10.4（AERAS－402），是一種過表達(dá)Mtb Ag85A、Ag85B和TB10.4融合蛋白的重組腺病毒35疫苗，目前在肯尼亞、莫桑比克、南非和烏干達(dá)進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗［5］。上述兩種病毒載體疫苗主要作為加強(qiáng)BCG的疫苗。

Miki等［6］構(gòu) 建 的2株 分 別 含 Ag85A 和Ag85B、MPB/MPT51的重組減毒李斯特菌，通過腹腔注射免疫C57BL/6小鼠，均能誘導(dǎo)PPD特異的足墊腫脹反應(yīng)、脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和產(chǎn)生IFN－γ；通過靜脈注射免疫BALB/c小鼠，也都能夠誘導(dǎo)比BCG強(qiáng)的免疫保護(hù)反應(yīng)。Hess等［7］報道結(jié)核Ag85B重組沙門菌疫苗可有效地誘導(dǎo)特異的IFN－γ和腫瘤壞死因子，也可保護(hù)小鼠抗Mtb的攻擊。

2.Mtb減毒活疫苗或其他的弱毒或無毒分枝桿菌活菌苗：通過隨機(jī)致突變或靶向同源重組技術(shù)從Mtb基因組中將某些與氨基酸的生物合成有關(guān)的基因、毒力基因或與Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)長期存活有關(guān)的基因敲除或致突變，制備Mtb減毒活疫苗。營養(yǎng)缺陷型減毒活疫苗在宿主體內(nèi)只能存活較短的時間，通過有限的復(fù)制來刺激機(jī)體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)許多Mtb氨基酸（甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、色氨酸、頡氨酸和泛酸鹽等）營養(yǎng)缺陷株可保護(hù)小鼠抵抗Mtb的攻擊，保護(hù)效力與BCG相當(dāng)，如嘌呤營養(yǎng)缺陷型突變株不能在鼠巨噬細(xì)胞中生長，在小鼠和豚鼠動物模型中的毒力也減弱［8］；Mtb Erdman亮氨酸營養(yǎng)缺陷株在鼠巨噬細(xì)胞中也不能生長，在SCID小鼠中毒力也減弱，它減少肺、脾組織中細(xì)菌數(shù)的效力不如BCG，但組織病理損害減輕［9］。Collins等［10］通過等位基因交換除去牛結(jié)核分枝桿菌esat－6基因，獲得2株牛結(jié)核分枝桿菌突變株 WAg520.4和 WAg530.1。WAg 520.4株保護(hù)肺的菌落計數(shù)與BCG相似，而抵抗細(xì)菌感染播散至脾的菌落計數(shù)比BCG少；WAg 530.1對脾的保護(hù)力與BCG無明顯差異，對肺的保護(hù)力比BCG差。最近發(fā)現(xiàn)，許多牛結(jié)核分枝桿菌弱毒株在豚鼠可誘導(dǎo)一定程度的抗結(jié)核保護(hù)，但缺乏pckA基因的菌株保護(hù)效力降低。在小鼠動物模型上已證明母牛分枝桿菌和恥垢分枝桿菌菌苗對Mtb的攻擊無保護(hù)作用，微小分枝桿菌菌苗多次注射后有一定的保護(hù)效力。

由此可見，減毒活疫苗的毒力和致病性顯著降低，其免疫保護(hù)效力與BCG相似或優(yōu)于BCG，但持續(xù)時間短，產(chǎn)生的記憶免疫效果也不佳，長期的穩(wěn)定性尚不清楚，存在毒力回復(fù)的問題。目前在減毒活疫苗的研究方面除了考慮減毒外，尚無明確的標(biāo)準(zhǔn)用于確定應(yīng)該加哪些基因、應(yīng)該去除哪些基因，無法判斷何種程度的減毒才是安全有效的。此外，即使獲得了Mtb減毒株，將來可能會發(fā)生返祖而造成疫苗安全性的問題。國內(nèi)較少研究。

3.DNA疫苗：由能引起機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原的編碼基因和真核表達(dá)載體構(gòu)建而成，它被注入機(jī)體后，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達(dá)蛋白抗原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。由于RNA疫苗不穩(wěn)定，在體內(nèi)存在時間短，表達(dá)短暫，生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸比DNA疫苗要求高。因此，目前研究最多的是DNA疫苗，它不需要任何化學(xué)載體，故又稱為裸DNA疫苗 （naked DNA vaccine）。DNA疫苗可誘導(dǎo)體液免疫和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）識別、殺傷、破壞被感染的細(xì)胞及清除細(xì)胞內(nèi)的病原體，這對于清除寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)的Mtb非常有意義。

目前，從Mtb分泌性蛋白和熱休克蛋白中已發(fā)現(xiàn)了多種保護(hù)性抗原的基因疫苗，如Ag85A、Ag85B、ESAT－6、MPT64、Pst S－3、Mtb8.4、hsp65、hsp70、PPE 家 族 （如 Rv3873、Rv1196、Rv0916c）等［11］，在動物模型上它們可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)效力與BCG相當(dāng)。DNA疫苗必須針對Mtb在增殖期和休眠期產(chǎn)生的抗原。不同的DNA疫苗具有不同程度的保護(hù)效力，某些DNA疫苗雖能刺激免疫應(yīng)答，但卻無保護(hù)效力或保護(hù)效力不如BCG，如Ag85C質(zhì)粒DNA免疫小鼠均未產(chǎn)生保護(hù)作用；Pst S－2 DNA免疫鼠只有脾菌落計數(shù)中等減少；Pst S－1 DNA免疫小鼠完全不能抑制細(xì)菌增殖；麻風(fēng)分枝桿菌和Mtb hsp60 DNA疫苗免疫小鼠后，雖然能誘導(dǎo)高水平的IL－2和IFN－γ，但Mtb氣霧攻擊，未見保護(hù)；富含脯氨酸的、相對分子質(zhì)量為36 000（36 k Da）的DNA疫苗對小鼠的保護(hù)效力不如BCG組；MPB70、MPB83 DNA疫苗或 MPB70 DNA疫苗/MPB70蛋白加強(qiáng)免疫牛都不能保護(hù)牛抵抗牛結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株對氣管內(nèi)的攻擊；相對分子質(zhì)量為19 000、ahpC與BCG的相對分子質(zhì)量為22 000的培養(yǎng)濾液蛋白、hsp10質(zhì)粒DNA免疫鼠，不能抑制組織中細(xì)菌增殖而無保護(hù)作用。此外，單個基因片段似乎不可能產(chǎn)生與BCG完全相同的免疫效果，只有編碼多個蛋白質(zhì)抗原的DNA才可能產(chǎn)生超過BCG的持續(xù)性保護(hù)作用。雖然基因疫苗在體內(nèi)表達(dá)的微量抗原蛋白能夠激發(fā)個體的免疫反應(yīng)，但很多情況下其強(qiáng)度仍弱于活疫苗，這一方面是由于疫苗DNA的轉(zhuǎn)化效率有限，同時也因為基因疫苗在宿主體內(nèi)不能像活疫苗那樣自我復(fù)制。尋找合適的免疫佐劑是增強(qiáng)基因疫苗免疫活性的重要手段，某些細(xì)胞因子能提高DNA疫苗的免疫應(yīng)答水平，如IL－2、IL－12或IFN－γ等，將能表達(dá)這些細(xì)胞因子的重組質(zhì)粒與結(jié)核病DNA疫苗聯(lián)合免疫，可提高免疫效果。Mtb多個基因聯(lián)合或融合疫苗免疫可誘導(dǎo)更高的保護(hù)效力［12］。部分DNA疫苗在小動物模型上的效果比在人體內(nèi)更有效，可能是由于小動物和人類理想的免疫刺激寡聚核苷酸不同所致。

結(jié)核病DNA疫苗不僅可作為治療性疫苗，也可作為預(yù)防性疫苗的加強(qiáng)型疫苗。雖然DNA疫苗對人類長期療效及安全性尚不清楚，但其制備及應(yīng)用較簡便，對于免疫低下者比BCG更安全。解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所和上海海規(guī)生物科技有限公司聯(lián)合研制的結(jié)核Ag85A DNA治療性疫苗，目前在武漢生物制品研究所正在進(jìn)行中試工藝研究［13］。國內(nèi)外尚未見結(jié)核DNA疫苗進(jìn)入臨床實驗的報道。

4.亞單位疫苗：其用 Mtb成分（如蛋白、多肽、枝菌酸、糖脂等）作疫苗組份，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)或免疫治療效果。其研制的關(guān)鍵在于保護(hù)性抗原和佐劑的選擇、劑量的確定，選擇抗原的主要標(biāo)準(zhǔn)是它們能否誘導(dǎo)保護(hù)性T細(xì)胞反應(yīng)，保護(hù)人群抗結(jié)核。亞單位疫苗在安全性方面更容易被接受，故非復(fù)制的亞單位疫苗只要與BCG保護(hù)效力相當(dāng)即可能用于人類臨床實驗。在Mtb早期培養(yǎng)濾液中有100多種蛋白，某些蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性和較好的保護(hù)效率，如抗原85復(fù)合物、ESAT6蛋白、相對分子質(zhì)量為38 000的脂蛋白、相對分子質(zhì)量為65 000的熱休克蛋白等。Mtb多種分泌蛋白混合或重組融合蛋白刺激的CD4＋T細(xì)胞反應(yīng)和獲得的保護(hù)效力均比單一蛋白成分強(qiáng)，但它們持續(xù)時間都較短。純蛋白抗原所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)比BCG弱，提示純化的蛋白疫苗的效力不如活的弱毒疫苗，但蛋白疫苗作為BCG免疫后的增強(qiáng)劑，保護(hù)效力明顯強(qiáng)于單獨(dú)BCG接種。然而，并非所有的蛋白免疫后都誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，如α－晶狀體球蛋白在休眠期增加表達(dá)，盡管具有免疫原性但無保護(hù)作用。

蛋白疫苗或多肽疫苗不加佐劑在動物體內(nèi)很難引起免疫反應(yīng)，同樣的抗原加上不同的佐劑誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)、產(chǎn)生的保護(hù)效力也不同，只有誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫的佐劑才能增強(qiáng)亞單位疫苗的抗結(jié)核免疫。這類佐劑主要有二甲基三十六烷基銨氯化物（簡稱DDA）、去?；鶈瘟姿犷愔珹（簡稱 MPL）、DDA/MPL佐劑、DDA/TDB佐劑、RC－529佐劑、含Cp G基序的寡聚脫氧核苷酸（Cp G ODN，可提高BCG抗Mtb感染的效力2～5倍，但不能增強(qiáng)亞單位疫苗的抗結(jié)核作用）［14］。微球體疫苗是將抗原裝入膠囊內(nèi)或聯(lián)結(jié)在微球體表面，裝入膠囊內(nèi)的抗原可避免酶降解和快速清除，并可控制抗原的釋放。Evans等［15］建立的 Mtb 8.4蛋白微球體，其2 h后的釋放率小于5%，48 h后小于10%，可持續(xù)、逐步地釋放超過5周；1次免疫就能夠誘導(dǎo)比MPL佐劑強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。至今尚無任何佐劑能使蛋白疫苗超過或達(dá)到BCG對動物的免疫保護(hù)效力。

丹麥國立血清研究所（SSI）研制的 Ag85BESAT6融合蛋白疫苗以IC31（寡脫氧核苷酸和多陽離子氨基酸的混合物）作為佐劑，在小鼠和靈長類動物的實驗結(jié)果均顯示其免疫保護(hù)力高于單一的ESAT－6或Ag85B蛋白疫苗，可增強(qiáng)BCG的免疫保護(hù)力，目前在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗［16］。美國葛蘭素公司（Glaxo－Smith Kline Biologicals，簡稱 GSK）研制的Mtb72f/AS02A嵌合蛋白疫苗，是由具有高度免疫原性的Mtb39和Mtb32基因重組構(gòu)建的相對分子質(zhì)量為72 000的嵌合蛋白，以MPL和皂角素QS21作為佐劑，豚鼠和猴子實驗結(jié)果表明作為BCG加強(qiáng)免疫制劑，誘導(dǎo)的保護(hù)效力強(qiáng)于單獨(dú)用BCG，目前在肯尼亞進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗［17］。AERAS、SSI、Sanofi和Intercell聯(lián)合研制的AERAS－404/H4IC，是Ag85B和TB10.4融合蛋白疫苗，以IC31為佐劑，目前正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗［18］。解放軍第三〇九醫(yī)院和蘭州大學(xué)研究的多種類型的蛋白疫苗，中國食品藥品檢定研究院研究的卡介菌Cp G復(fù)合佐劑－02系統(tǒng)，目前均處于臨床前研究階段。

四、新疫苗研制需要解決的問題

1.需闡明Mtb的致病機(jī)制和機(jī)體的免疫保護(hù)機(jī)制：（1）無論是BCG還是Mtb都不能誘發(fā)全面的特異性的免疫反應(yīng)及足夠強(qiáng)度的免疫回憶反應(yīng)，只能誘導(dǎo)免疫抑制Mtb生長，不能完全清除體內(nèi)的Mtb。然而90%的Mtb感染者終生不會發(fā)病的事實又表明結(jié)核自然感染所誘發(fā)的免疫反應(yīng)能為大部分感染者提供有效的保護(hù)反應(yīng)，若能清楚地了解個體發(fā)病或不發(fā)病的機(jī)制，了解Mtb抗原的生物學(xué)特性、轉(zhuǎn)錄、代謝通路，有的放矢地設(shè)計理想的疫苗，預(yù)防Mtb感染發(fā)病將成為可能。（2）宿主與 Mtb的相互作用復(fù)雜，目前研究顯示結(jié)核患者的免疫應(yīng)答呈現(xiàn)有利于Mtb的生存與傳播。感染者是否發(fā)病是取決于Mtb的致病力、感染的菌量、個體的易感性，還是機(jī)體免疫系統(tǒng)是否遭到其他不利因素的影響？哪些免疫參數(shù)可作為疫苗有效性的評價指標(biāo)？選擇哪些指標(biāo)來評價新疫苗更有意義（一般狀況改善、菌落計數(shù)減少、細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)、存活期延長）？（3）在結(jié)核高度流行區(qū)域，許多人已感染Mtb，甚至有亞臨床病變，他們?nèi)艚邮軓?qiáng)的免疫原，隨后產(chǎn)生的宿主免疫反應(yīng)是否會清除接種的疫苗？是否會激發(fā)潛伏的感染發(fā)生嚴(yán)重疾病？（4）部分人群感染了非結(jié)核分枝桿菌，這對未來的疫苗將會產(chǎn)生怎樣的影響？

2.需開展合理的疫苗設(shè)計和免疫策略研究：（1）疫苗的設(shè)計既要針對增殖期的抗原（如Ag85A和Ag85B），也要針對休眠期的抗原，選擇哪些抗原聯(lián)合構(gòu)建疫苗才有可能誘導(dǎo)更有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答？（2）亞單位疫苗在體內(nèi)激發(fā)的免疫反應(yīng)，在很多情況下其強(qiáng)度弱于活疫苗，需尋找合適的免疫佐劑增強(qiáng)其免疫活性。（3）新疫苗評價需要大量的人群和長期的隨訪觀察，在BCG廣泛接種的結(jié)核病高流行國家，選擇大樣本量的現(xiàn)場評估將遇到困難。而且，BCG將對新疫苗產(chǎn)生什么樣的影響？BCG將如何與新疫苗聯(lián)合免疫？新疫苗的類型、免疫的順序、免疫的間隔時間、免疫的次數(shù)等免疫策略問題將是今后研究的重點之一。

3.需探索免疫治療機(jī)制：結(jié)核病疫苗用于免疫治療是一個新的探索領(lǐng)域，滅活的母牛分枝桿菌和草分枝桿菌制劑已在臨床應(yīng)用，治療效果尚有爭議，未達(dá)到“超短程化療”的目的，其原因可能是滅活的細(xì)菌成分只能誘導(dǎo)短暫的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，不能誘導(dǎo)特異的CTL應(yīng)答，部分患者可能應(yīng)用不當(dāng)導(dǎo)致免疫耐受。但關(guān)鍵是目前尚未完全闡明結(jié)核病的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，結(jié)核病是一種感染性疾病，也是一種免疫疾病，結(jié)核免疫反應(yīng)是一把雙刃劍，如何應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)手段，從結(jié)核抗原致敏到機(jī)體免疫應(yīng)答的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)和免疫干預(yù)，促進(jìn)其生理反應(yīng)而抑制其病理作用，趨利避害，是今后需要進(jìn)一步深入研究的方向。

臨床前研究期間從動物模型上獲得了一些基礎(chǔ)免疫數(shù)據(jù)，但小動物和人類的免疫還是有一定的差異；臨床醫(yī)生對于疫苗能調(diào)動機(jī)體的免疫活性，輔助化療殺滅、抑制細(xì)菌，清除在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存的間歇休眠菌、持留菌的認(rèn)識不足；臨床上免疫制劑的應(yīng)用不夠規(guī)范，對免疫制劑的用量、應(yīng)用時機(jī)、療程、應(yīng)用對象的免疫狀況及對患者免疫的影響等尚缺乏深入的研究。

4.需建立有效的疫苗評價模型：動物實驗可為人類提供疫苗的安全性、免疫活性及有效性的評價，但并不能反映人類的免疫反應(yīng)，尤其是長效型的免疫保護(hù)反應(yīng)。如BCG在動物模型中具有很好的保護(hù)性，但近90年的人類應(yīng)用效果并不理想。目前小動物、靈長類動物實驗的結(jié)果將為人類有效疫苗的研制提供哪些有價值的依據(jù)？因此，有必要建立更有效的體內(nèi)和體外疫苗評價模型。

隨著科學(xué)的步伐只爭朝夕地跨越，相信上述問題會得到圓滿地解決。在過去的10年已有10種新型結(jié)核病疫苗進(jìn)入Ⅰ期或Ⅱ期臨床實驗，均未出現(xiàn)安全問題或免疫病理發(fā)生，但預(yù)防性疫苗的臨床實驗周期長，還有一段較長的路要走。而治療性疫苗的臨床評價周期短，相信在不久的將來將看到新疫苗在結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病患者的輔助治療及潛伏感染者的預(yù)防治療方面發(fā)揮作用。

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