陳振華 范雄林

據(jù)WHO統(tǒng)計，全球TB的發(fā)病率和新發(fā)患者數(shù)在近幾年來均呈現(xiàn)下降趨勢。2010年全球報告病例約880萬，145萬例死亡［1］，這受益于各國對TB防治的重視和新技術(shù)在TB防治上的應(yīng)用。但要實現(xiàn)TB的有效控制和WHO提出的2050年消除TB對全球公共衛(wèi)生的影響的目標(biāo)，仍面臨著幾個重大的問題：全球約1/3的人口感染了Mtb成為潛伏感染者（latent TB infection，LTBI），且5%～10%的LTBI一生中可能經(jīng)內(nèi)源性感染發(fā)展成為活動性TB患者［1］；耐多藥結(jié)核?。∕DR－TB）在TB高負(fù)擔(dān)國家流行［2］，廣泛耐藥結(jié)核病（XDR－TB）甚至完全耐藥結(jié)核?。═DR－TB）等已經(jīng)出現(xiàn)［3－5］；與 HIV 共感染，TB患者的病死率增加［6］。這些都對TB的防治提出了更高的要求。

BCG自1921年第一次應(yīng)用于人類免疫接種預(yù)防TB以來，已累計有30億人次接種，目前仍在以大約每年300萬人群的接種速率遞增［7］，對預(yù)防兒童重癥TB的發(fā)生和降低病死率起著舉足輕重的作用。盡管BCG在全世界范圍內(nèi)被如此廣泛地運(yùn)用，但并非理想的抗TB疫苗（在嬰兒出生時接種即可獲得終生的保護(hù)性免疫）。臨床試驗和流行病學(xué)調(diào)查表明，BCG對成人TB的保護(hù)效率在0%～80%之間波動［8］。產(chǎn)生這種不穩(wěn)定的免疫保護(hù)可能是由于在新生兒出生后接種BCG所誘導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答通常僅維持10～15年，隨著免疫后時間的延長對TB的預(yù)防作用逐漸減退［9］。這也是目前TB疫情不能得到更好控制的主要原因之一。因此，加快發(fā)展新型的TB疫苗及免疫策略是緩解這一全球性公共衛(wèi)生問題的有效措施。

TB疫苗的研制思路主要在于發(fā)展比BCG誘導(dǎo)的免疫保護(hù)更強(qiáng)、保護(hù)期更長的疫苗，從而取代BCG用于免疫接種。國內(nèi)外學(xué)者通過大量的動物試驗和臨床研究，獲得了共識：目前僅2種類型的疫苗具有上述潛力。一是以BCG為基礎(chǔ) 的 改 造 BCG，如：r BCG30［10］、VPM 1002［11］、Aeras－422［12］和國內(nèi)的r BCG∶∶85B－Rv3425［13］和rBCG∶∶X等［14］，已證實在實驗動物中具有比BCG更好的保護(hù)效率。二是以Mtb為基礎(chǔ)的營養(yǎng)和（或）毒力缺失突變株，如：MtbΔRD1 Δpan CD［15］和 Mtb VAC［16］，具有與BCG相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)效率。

針對BCG免疫保護(hù)的缺陷和新型疫苗研制的困鏡，BCG的初次免疫（以下簡稱為初免）－增強(qiáng)策略（prime－boost strategy）被提出用于TB的預(yù)防。

一、同源性BCG初免－BCG增強(qiáng)策略

同源性增強(qiáng)，即用相同的疫苗再次或多次進(jìn)行加強(qiáng)免疫。鑒于目前大部分人群都已接種過BCG，因此用BCG重復(fù)免疫，以期得到更持久、更有效的保護(hù)效果。Corner等［17］在非嚙齒動物負(fù)鼠模型中用BCG初免、BCG增強(qiáng)并未發(fā)現(xiàn)任何有利的免疫反應(yīng)的改變。這一結(jié)論在小鼠模型的研究中也得到支持［18－20］。Buddle等［21］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用 BCG重復(fù)免疫牛后，發(fā)生了更為嚴(yán)重的、肉眼可見的TB病理性改變。而且，各地人群流行病學(xué)調(diào)查對BCG重復(fù)接種的效果提供了更有說服力的證據(jù)?；仡櫺匝芯勘砻?，20世紀(jì)90年代芬蘭中斷BCG的重復(fù)接種并未對TB的發(fā)病率產(chǎn)生任何影響［22］；匈牙利和俄羅斯實施的BCG再免疫計劃，建議國民從出生到30歲期間連續(xù)接受5次BCG免疫，但沒有找到可靠的證據(jù)表明該計劃的實施有利于這些地區(qū)TB的防治［23－24］。巴西開展的一項針對7～14歲兒童的前瞻性研究表明，重復(fù)接種BCG未能使抗TB的保護(hù)性產(chǎn)生任何實質(zhì)性的提高［25］。馬拉維進(jìn)行的人群前瞻性研究也得出了相似的結(jié)果［26］。所以，盡管BCG未能增強(qiáng)BCG初免的免疫保護(hù)機(jī)制 尚 不 清 楚，WHO（1995 年）［27］和 我 國 衛(wèi) 生 部 （1997年）［28］均先后不推薦這一策略用于TB的預(yù)防。

二、BCG初免－異源性增強(qiáng)策略

既然再次免疫BCG的同源性增強(qiáng)策略沒有取得預(yù)期的效果，國內(nèi)外學(xué)者轉(zhuǎn)而探索異源性增強(qiáng)策略。異源性增強(qiáng)（heterologous boost），即用相對于初免疫苗類型不同的抗原遞送系統(tǒng)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。疫苗類型包括亞單位蛋白疫苗、DNA免疫和活病毒載體疫苗等形式，保護(hù)性抗原以BCG與Mtb共同表達(dá)或僅Mtb表達(dá)的抗原為基礎(chǔ)。

1.亞單位蛋白疫苗增強(qiáng)：亞單位蛋白疫苗應(yīng)用于人體已經(jīng)被證實是比較安全的。它可誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠強(qiáng)度的T細(xì)胞反應(yīng)，尤其是CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)，但仍需要使用更高效的T細(xì)胞佐劑且須反復(fù)實施多次免疫［29－31］。2004年，GSK公司報道的抗TB候選疫苗，即Rv1196和Rv0125嵌合蛋白r Mtb72F增強(qiáng)BCG初免小鼠和豚鼠的免疫保護(hù)效果，r Mtb72F增強(qiáng)組可以減輕BCG單獨(dú)免疫組動物肺臟感染Mtb后的肺實變、促進(jìn)病損的愈合［32］。Andersen等［33］利用 CTA1－DD（由霍亂毒素A1單元酵素活性和葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白鍵結(jié)組成的一種口腔黏膜佐劑）作為融合蛋白Ag85B－ESAT－6的佐劑，經(jīng)鼻對小鼠反復(fù)實施增強(qiáng)免疫，結(jié)果表明：BCG和蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用組的CD4＋T細(xì)胞的反應(yīng)明顯高于僅皮下注射免疫BCG組。類似的，Dietrich等［34］用大腸埃希菌不耐熱腸毒素LTK63作為Ag85B－ESAT－6的佐劑，也增強(qiáng)了BCG初免過的小鼠的保護(hù)性。Brooks等［35］用單磷酰脂（MPL）作為佐劑，聯(lián)合Ag85A注射到BCG初免的成年小鼠體內(nèi)，也可增強(qiáng)BCG抗TB的能力。然而，Majlessi等［36］用減毒百日咳桿菌腺苷環(huán)化酶－Ag85A融合蛋白或者減毒百日咳桿菌腺苷環(huán)化酶－ESAT－6融合蛋白，雖增強(qiáng)了BCG∶∶RD1初免的特異性T細(xì)胞免疫，但其抗 Mtb的保護(hù)效力不及BCG∶∶RD1單獨(dú)免疫組。Mtb主要分泌蛋白抗原85B（Ag85B）可增強(qiáng)BCG或過表達(dá)Ag85B的rBCG30初免豚鼠所誘導(dǎo)的免疫性，也并未有效地提升抗TB的保護(hù)性［37］。因此，免疫反應(yīng)的加強(qiáng)不一定與保護(hù)效力的提高呈正相關(guān)。此外，免疫保護(hù)性抗原的選擇也是亞單位疫苗異源性增強(qiáng)應(yīng)用的一個重要影響因素。例如，在不同感染狀態(tài)人群中針對Mtb黏附素之一的肝素結(jié)合血凝素（HBHA）的體液免疫與細(xì)胞免疫的反應(yīng)均不同。HBHA可刺激潛伏感染者外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的γ干擾素（IFN－γ）。在初免過BCG的新生期和成年小鼠模型中，HBHA可明顯增強(qiáng)BCG的免疫性，且初免與增強(qiáng)的時間間隔越長，觀察到的增強(qiáng)效應(yīng)越顯著［38］。因此，加強(qiáng)篩選適用于亞單位疫苗異源性增強(qiáng)的靶抗原，以及研究保護(hù)性增強(qiáng)的機(jī)制是未來的方向。

2.DNA疫苗增強(qiáng)：多種 Mtb抗原的編碼基因已作為DNA疫苗的主要靶抗原［39］，部分免疫小鼠被證實可以提供不同程度的保護(hù)以抵抗 Mtb的攻擊［40］，但保護(hù)作用均未超過BCG。Mollenkopf等［41］最先報道Mtb Rv3407 DNA疫苗增強(qiáng)BCG初免的小鼠模型，經(jīng)過2次重復(fù)DNA疫苗免疫的小鼠對Mtb氣溶膠感染的抵抗力較BCG或DNA單獨(dú)免疫組強(qiáng)。此后，DNA疫苗異源性增強(qiáng)免疫策略日益受到關(guān)注。筆者在表達(dá)ESAT6為基礎(chǔ)的DNA疫苗和BCG聯(lián)合應(yīng)用的試驗中證實了BCG缺失而Mtb特異表達(dá)的蛋白可以用于異源性增強(qiáng)免疫策略［42］。進(jìn)一步的研究還證實以BCG缺失基因為基礎(chǔ)的融合蛋白DNA疫苗可以增強(qiáng)BCG初免小鼠或?？?Mtb感染的保護(hù)性［43－47］。表達(dá) Mtb HSP65的DNA疫苗，以及表達(dá)白細(xì)胞介素－12（IL－12）的DNA疫苗增強(qiáng)BCG初免策略，可以使獼猴抗Mtb攻擊感染的存活率達(dá)到100%［48］。

DNA疫苗具有多效性、免疫作用時間長、制造和儲藏方便、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，不過進(jìn)入人體的DNA有可能整合到基因組中，其安全性還需要更深入的研究。但并不妨礙此技術(shù)作為一種在動物模型中篩選可增強(qiáng)BCG抗Mtb的靶抗原的高效方法。

3.活病毒載體疫苗增強(qiáng)：抗TB的病毒載體疫苗目前最常用的包括痘病毒載體和腺病毒載體。痘病毒載體疫苗已經(jīng)用到HIV感染者并證實安全，改良安卡拉痘病毒（modified vaccinia virus Ankara，MVA）就是其中之一。Williams等［49］和 Verreck 等［50］在 豚 鼠 和 獼 猴 模 型 均 證 明 了 表 達(dá)Ag85A的MVA85A病毒載體疫苗增強(qiáng)BCG初免方案，不僅能獲得比BCG或MVA85A單獨(dú)免疫更強(qiáng)的特異性T細(xì)胞反應(yīng)，還具有更強(qiáng)的保護(hù)性。在英國、岡比亞和南非等地，MVA85A已進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗，MVA85A免疫健康的未接種過BCG和接種過BCG的自愿者，均提示安全且能有效地誘導(dǎo)多功能T細(xì)胞應(yīng)答。但是，MVA85A是否能夠增強(qiáng)BCG初免產(chǎn)生的免疫反應(yīng)和放大機(jī)體自身的免疫效應(yīng)，在不同地區(qū)出現(xiàn)了差異。英國兩者均可產(chǎn)生；岡比亞和南非的接種過BCG和未接種BCG的自愿者在免疫M(jìn)VA85A前后并沒有明顯的差別，這可能與環(huán)境分枝桿菌對BCG免疫接種作用的弱化有關(guān)［51－52］。近期，南非仍在繼續(xù)開展針對無TB和HIV感染史且接種過BCG的嬰幼兒的相關(guān)研究［53］，英國則在進(jìn)一步研究將MVA85A應(yīng)用于LTBI的預(yù)防［54］。

Wang等［55］和 Xing等［56］構(gòu)建了能表達(dá) Ag85A、具有復(fù)制缺陷的重組人類腺病毒5型，即Ad Ag85A。在小鼠和豚鼠模型中驗證了Ad Ag85A可以增強(qiáng)BCG初免后產(chǎn)生的保護(hù)性免疫［57－58］，現(xiàn)已開始臨床試驗。表達(dá) Ag85A、Ag85B 和TB10.4的融合抗原蛋白的重組腺病毒疫苗AERAS－402，在南非的臨床期試驗已經(jīng)證明可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多功能T細(xì)胞，以及強(qiáng)烈而持久的CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)，且免疫健康成年人是安全可靠的［59］。

重組病毒疫苗的優(yōu)勢在于安全，不需要佐劑，而且可以多途徑免疫接種、刺激機(jī)體產(chǎn)生廣泛而持久的CD4＋和CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)，是未來重點研究的方向之一。

三、結(jié)論

BCG作為目前惟一應(yīng)用于臨床的預(yù)防TB的疫苗，雖然對成人的保護(hù)效果不穩(wěn)定，但它所提供的對新生兒到青少年階段的保護(hù)效力是目前任何一種非BCG為基礎(chǔ)的候選疫苗無法超越的。而且，BCG已經(jīng)納入WHO的全球擴(kuò)大免疫計劃，目前全球159個國家和地區(qū)接種BCG，覆蓋率高達(dá)90%。在今后相對長的時間內(nèi)，尚不可能有一種疫苗能夠取代BCG。探索與BCG進(jìn)行聯(lián)合免疫的增強(qiáng)方案以維持或提高人群現(xiàn)有本身的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)，不僅有很強(qiáng)的可行性，并且符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)原則。目前已經(jīng)進(jìn)行臨床試驗的總共11種方案，其中8種均是采用增強(qiáng)BCG初免的策略。未來研究將更加強(qiáng)調(diào)以亞單位或重組病毒載體為基礎(chǔ)的異源性增強(qiáng)BCG初免的策略，同時將深入異源性增強(qiáng)免疫的疫苗類型、增強(qiáng)途徑和機(jī)制等方面的研究。依據(jù)目前這些策略在臨床前研究中獲得的有效性，有理由相信異源性增強(qiáng)策略將會為TB預(yù)防提供新的臨床免疫方案。

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