張承昊(綜述)，劉 毅(審校)

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 關節(jié)外科，貴州 遵義 563099)

韌帶組織工程學種子細胞的研究進展

張承昊(綜述)，劉 毅(審校)

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 關節(jié)外科，貴州 遵義 563099)

韌帶；組織工程；種子細胞；生物學環(huán)境；力學環(huán)境

近幾年運動損傷醫(yī)學的迅速發(fā)展，韌帶重建技術越來越成熟，重建后的關節(jié)功能可以得到滿意的穩(wěn)定性和較好的功能恢復，而韌帶重建術中移植物目前尚未找到滿意的供體。臨床上通常使用自體韌帶、異體韌帶或人工韌帶【1-5】，這幾種移植物都存在一些自身難以避免的缺陷，如自體韌帶存在供區(qū)少，供區(qū)功能丟失，供區(qū)疼痛等，異體韌帶存在價格昂貴，潛在傳播疾病，免疫排斥等風險，人工韌帶的長期使用存在疲勞斷裂，多適用于急需恢復關節(jié)功能的患者【6，7】。隨著組織工程學的發(fā)展，組織工程學為韌帶重建提供了可以和人體韌帶具有相近活性、功能的組織工程學韌帶是具備了韌帶的活性和自我營養(yǎng)、更新的能力，可逐步演變成人體內(nèi)的韌帶，不再僅僅是移植物，使運動醫(yī)學從修復韌帶逐步向重構韌帶發(fā)展。韌帶組織工程學主要包括種子細胞、支架材料、誘導條件等幾方面，其中種子細胞做為韌帶的“種子”，在韌帶構建中起到了合成韌帶構建各種蛋白和分子，構建韌帶結(jié)構，維持重建后韌帶的營養(yǎng)和代謝等重要作用。

1 韌帶組織工程學種子細胞的特點和來源細胞

目前組織工程學韌帶的構建主要有兩種方式：第一種也是目前研究、應用最廣泛的方法，即韌帶由可降解的支架材料和能夠替代支架材料的細胞構成，通過細胞自身分泌膠原蛋白，替代支架降解的膠原，最終形成新的韌帶組織【8，9】；另一種方法是通過外界誘導條件，如機械力、生長因子等，作用于細胞，使其分泌膠原并形成韌帶結(jié)構，具備韌帶功能【10】。這些方法中所需要的細胞我們稱之為“組織工程學韌帶的種子細胞”(以下簡稱種子細胞)【11】，種子細胞在組織工程學韌帶的產(chǎn)生中起重要作用，是韌帶組織工程學中關鍵部分。

1.1 種子細胞的特點 種子細胞在韌帶組織工程學中起到了重要作用，是重建韌帶的基礎以及膠原及非膠原蛋白等主要來源，種下什么樣的“種子”才能得到重建韌帶。針對各種研究中需要種子細胞的功能，我們總結(jié)了做為成熟的種子細胞所需要具備的特點： ① 對外界環(huán)境改變有一定承受能力，對支架材料、機械力刺激等具有一定的相容性；② 細胞在外界刺激下能夠分泌膠原蛋白、粘蛋白等構成韌帶所必須的蛋白，所產(chǎn)生蛋白之間的比例應與韌帶結(jié)構內(nèi)蛋白組成相類似；③細胞能夠自身分泌相關生長因子及生化因子，通過自分泌及旁分泌誘導分泌膠原蛋白及韌帶相關蛋白；④細胞可以構建韌帶結(jié)構，在如機械力刺激下能夠與膠原蛋白構成韌帶組織的組織學結(jié)構，輔助膠原排列并提供營養(yǎng)支持。

1.2 種子細胞的篩選 目前并沒有韌帶組織工程學種子細胞譜系，需要從目前已得到的細胞中篩選，并予以適當?shù)恼T導、修飾。目前細胞的來源主要有干細胞，成熟體細胞，iPC等，這些細胞可以在不同方面滿足種子細胞的要求，但都不能完全勝任種子細胞。在目前研究中具有多分化能力的間充質(zhì)干細胞和韌帶成纖維細胞研究較多、較成熟，成為主要研究對象。①干細胞已被證明有多分化能力，在一定誘導條件下，通過控制其培養(yǎng)的微環(huán)境可促進干細胞向韌帶種子細胞分化，使其合成韌帶組織所需要的膠原蛋白，韌粘蛋白等相關蛋白的基因表達活性增高，蛋白分泌增多【12-14】； ②韌帶成纖維細胞做為韌帶組織中主要細胞結(jié)構并起到營養(yǎng)支持韌帶組織，在韌帶修復中亦起到巨大作用，其通過爬行替代，分泌活性因子如生長因子，以及膠原酶等促進韌帶修復【15，16】。目前關于其他來源的細胞尚處于初期階段，缺乏深入研究的相關報道。

僅僅分離出干細胞和韌帶成纖維細胞是不能夠達到組織工程學韌帶種子細胞的要求，需要對各種來源的細胞進行一定程度的處理、加工。在這些處理主要針對提高細胞活性、增加膠原蛋白產(chǎn)量，改善細胞相容性，以及在結(jié)構上重新排列細胞及相應膠原構建韌帶組織這幾方面。

2 誘導初級細胞向韌帶種子細胞分化的方法

由于干細胞和韌帶成纖維細胞等細胞無法完全滿足種子細胞的要求，必須予以誘導或基因修飾，所以我們將這些細胞稱為初級細胞。對于初級細胞的誘導方法根據(jù)調(diào)控方法不同，通過改變細胞的生物學環(huán)境和/或力學環(huán)境來誘導細胞，力學環(huán)境是通過各種力學刺激細胞增殖，沿受力方向分布，增加細胞膠原蛋白產(chǎn)量等，誘導細胞分化。與力學環(huán)境不同生物學環(huán)境主要通過改變細胞周圍的微環(huán)境內(nèi)各種因子、蛋白的濃度提高細胞活性，誘導細胞分化。其中生長因子在細胞外基質(zhì)中的變化對細胞的影響最大，應用也最多。

2.1 誘導分化的概況 誘導初級細胞的分化時，均要求較高的細胞活性和增殖能力。根據(jù)有無支架，對細胞外基質(zhì)的合成種類、產(chǎn)量要求不同，對誘導環(huán)境的要求也不同。在有支架的條件下，主要通過細胞分泌膠原蛋白來替代可降解的細胞，并通過細胞分泌韌帶相關因子和分子來營養(yǎng)韌帶，進行韌帶代謝，這樣對于細胞早期分化程度要求較高，成纖維細胞可以滿足韌帶代謝所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。如果沒有支架，通過細胞直接構建韌帶組織，則需要細胞分泌大量膠原蛋白，并要早期對細胞和所分泌的蛋白進行誘導排列，可以通過機械力等力學刺激，使細胞沿受力方向排列，構建韌帶結(jié)構，所以在不同的條件下生物學環(huán)境和力學環(huán)境所起的作用不同，各自的重要性不同。

2.2 生長因子對種子細胞的作用 韌帶修復過程中有大量的、多種生物分子表達上調(diào)，其中生長因子是這些生物分子中最重要的一部分。生長因子可以促進纖維增殖、遷移，持續(xù)增加膠原蛋白的產(chǎn)量起到修復、重建韌帶的作用【17-19】。針對生長因子的這些特性，經(jīng)過長期大量的研究，最符合韌帶組織工程學要求的生長因子主要有以下5個：胰島素生長因子-1(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、血管生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)。

在實驗應用中不同的生長因子對干細胞及韌帶成纖維細胞的影響作用不同，目前對于各種生長因子的作用研究認為IGF-1及TGF-β在韌帶損傷中具有炎性反應活性。IGF-1可以增加細胞增殖和遷移，刺激細胞外液產(chǎn)生；TGF-β可調(diào)節(jié)細胞遷移、蛋白質(zhì)表達、纖維蛋白束相互作用，刺激膠原蛋白的產(chǎn)生。VEGF、PDGF、bFGF在韌帶損傷時可以引導新生血管、細胞遷移，此外PDGF還可以調(diào)節(jié)損傷部位蛋白和DNA的合成，調(diào)節(jié)其他生長因子的表達，從而促進細胞增殖，結(jié)構重建【20】大量體外細胞培養(yǎng)實驗證明，這些生長因子均可促進干細胞活性增加，膠原蛋白和韌帶相關蛋白mRNA表達增多，蛋白產(chǎn)量提高，故這些生長因子已經(jīng)廣泛的應用于干細胞的體外誘導。

同時有研究表明聯(lián)合應用生長因子可以提高對干細胞的誘導作用，增加膠原蛋白、韌粘素蛋白的產(chǎn)量【21】，在體內(nèi)這些作用主要通過細胞的旁分泌和自分泌等作用，體外培養(yǎng)中通過生長因子作用于種子細胞表面的靶點。但大劑量的生長因子對干細胞的誘導作用并不明顯，以bFGF為例，其于12.50 ng / mL 出現(xiàn)促增殖效應(P<0.05) ；25.00 ng /mL組與12.50 ng /mL 組比較,作用提高(P<0.01) ；50、100ng /mL 組較25.00 ng /mL 組無明顯提升(P>0.05)【22】。這種現(xiàn)象可能與生長因子作用于細胞的靶點量有關，當細胞上的作用靶點飽和后，再增加生長因子的量并不能夠進一步影響細胞代謝。因此有研究者使用兩種作用于不同靶點的生長因子共同作用于種子細胞來促進細胞增殖、分化，提高蛋白產(chǎn)量。

2.3 共培養(yǎng)對細胞誘導的作用 共同培養(yǎng)可以通過成熟體細胞來誘導干細胞分化，韌帶組織工程學主要是通過將干細胞和韌帶成纖維細胞共同培養(yǎng)，希望通過LF促進干細胞的分化，通過大量實驗后，得到了很令人高興的結(jié)果，在將兩種細胞共同培養(yǎng)后，干細胞的Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白及韌帶相關蛋白如Tenascin-C和scleraxis等產(chǎn)量明顯增加【23,24】。目前大多數(shù)共同培養(yǎng)的實驗中為了證實LF對干細胞的作用多采用分層滲透培養(yǎng)，即雖然將兩種細胞置于同一培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，但用一層多孔膜相隔，兩種細胞或分為上下層，或分內(nèi)外層，有效因子通過在培養(yǎng)液中彌散，通過旁分泌和自分泌而相互作用【25】。除此之外單層共培養(yǎng)細胞還可以通過細胞間接觸和縫隙連接來相互作用，這兩種作用已經(jīng)被證實對干細胞的分化起到了十分積極的作用，其重要性并不低于有效因子的旁分泌作用【26】。細胞與細胞間的接觸作用可以作為獨立的誘導方法作用于干細胞的分化，有實驗證明沒有直接接觸體細胞可能不能作用于干細胞，如Kin H等研究表明分層培養(yǎng)成骨細胞和BMSC，BMSC并沒有被誘導【27】。此外縫隙連接不僅是另一個獨立的誘導機制，還被證實其在細胞分化的過程中表達水平和活性都發(fā)生著變化，對分化具有調(diào)節(jié)作用，如Boucher等證實了在神經(jīng)前體細胞分化過程中縫隙連接蛋白的種類、數(shù)量、活性不斷發(fā)生變化【28】。

生長因子通過作用于細胞表面的特定受體，以TGF-β為例，實驗證明MSC膜表面存在高度親和TGF-β的受體TβRⅠ和TβRⅡ【29】，隨著劑量的增加細胞表面受體飽和度越高，而使其作用越強。但高濃度的生長因子作用于細胞使細胞的特定受體飽和有引起細胞老化、凋亡的可能性。使生長因子誘導達到了一個瓶頸，為了突破瓶頸，將干細胞與成熟體細胞共同培養(yǎng)，由于其可分泌多種生長因子，模擬體內(nèi)的分化環(huán)境，作用更溫和、更持久，改善了誘導環(huán)境。陳宗雄等實驗證明關節(jié)軟骨細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞1∶2比例間接共培養(yǎng)的結(jié)果與10ng/mL的TGF-β的誘導作用相當，但細胞活性卻比生長因子誘導結(jié)果高【30】。

2.4 生物力學對種子細胞的誘導作用 韌帶組織是致密結(jié)締組織，在結(jié)構上比骨、軟骨組織要求更高，根據(jù)韌帶的結(jié)構，可知成纖維細胞和其分泌的膠原、非膠原蛋白需構成高度有序的交互性結(jié)構，這種分層結(jié)構證明這些組織需要抗張力的性質(zhì)，這種性質(zhì)需要通過一定力學刺激來構建，生物環(huán)境的改變對其作用微乎其微。但是目前為止，對種子細胞的研究大多局限在細胞活性、分化程度、蛋白產(chǎn)量等統(tǒng)計學分析中。

為了達到這一目的研究者們也開始對韌帶的力學環(huán)境進行研究，近些年通過增加生物力學、機械力刺激使韌帶組織工程學得到了巨大的改變。有研究者通過利用機械力刺激成纖維細胞，誘導細胞線性排列，調(diào)整細胞外基質(zhì)的組成。機械力刺激還可以提高細胞增殖能力，增加細胞外基質(zhì)的合成，增強細胞向特殊纖維連接組織分化能力【31-33】。實驗證明機械力刺激可提高韌帶成纖維細胞和干細胞等細胞的膠原蛋白及韌粘素產(chǎn)量，并且促進細胞沿受力方向排列，使細胞沿受力方向拉伸，細胞骨架發(fā)生變化【34-36】。Altman證明機械力刺激可以促進間充質(zhì)干細胞分化具有韌帶成纖維細胞表型表達，這些實驗證明機械力刺激在成功構建組織工程學韌帶中必不可少。

力學環(huán)境的誘導作用與生物環(huán)境相比，力學環(huán)境能夠通過細胞的力傳導作用調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成和重組。力傳導作用通過將生物力學轉(zhuǎn)換成細胞的信號通路反應來調(diào)節(jié)細胞增殖，分化和細胞外基質(zhì)的合成。在特殊的具有生物力學性質(zhì)細胞信號傳導連級反應中，細胞外基質(zhì)蛋白、生長因子、細胞表面受體因子的一系列作用將生物力學信號傳達到細胞內(nèi)，觸發(fā)了細胞內(nèi)的信使使特殊基因表達蛋白磷酸化【37，38】。在力傳導過程中，整合蛋白附著于細胞外基質(zhì)蛋白在細胞外基質(zhì)和細胞內(nèi)結(jié)構之間建立一個物理通道【39】，這一通路通過將細胞外基質(zhì)的物理牽張力轉(zhuǎn)換為細胞內(nèi)信號來改變基因表達。Miyaki報道機械牽張刺激細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)傳導通路，這一通路控制前交叉源性細胞的Ⅰ型膠原和飾膠原蛋白的表達【40】。機械力刺激同樣已經(jīng)被報道可以誘導細胞增殖、分化，細胞線性排列及細胞外機制的表達和重建【41,42】。

3 目前種子細胞誘導效果和研究方向

隨著韌帶組織工程學的進展，越來越多的誘導方式作用于種子細胞，經(jīng)過誘導后對誘導的細胞作用效果評價尚沒有統(tǒng)一的要求，結(jié)合目前各種關于種子細胞誘導的文獻，對于誘導的結(jié)果主要包括：細胞的活性和增殖能力，細胞外基質(zhì)的表達和合成，細胞在力學刺激下細胞形態(tài)和排列。

首先，細胞的活性和增殖能力是基礎，只有獲得足夠多的細胞，細胞活性高，才能對細胞進行進一步的誘導，目前各種誘導方式中，首先就要檢測細胞的活性和增殖能力。高活性的細胞，對誘導條件敏感，誘導作用明顯，誘導效果好于其他細胞，這些細胞在誘導作用下可以合成大量的目的蛋白、因子等，如干細胞活性較成熟體細胞高，在多種誘導方式下其誘導作用好，蛋白產(chǎn)量增加明顯。細胞的高活性同樣反映在增殖能力，細胞活性高時，細胞增殖迅速成指數(shù)增長，細胞活性低時細胞增殖較慢，易老化、凋亡。細胞數(shù)量增多后相關蛋白產(chǎn)量也會提高，如bFGF可以明顯提高細胞增值能力，所以其誘導下相應蛋白的產(chǎn)量也會提高【43】。細胞的活性和增殖能力是誘導的基礎，任何誘導方式都要在不抑制細胞活性，不妨礙細胞增殖的前提下發(fā)揮作用。

細胞合成的細胞外基質(zhì)是構建韌帶的原材料，這些蛋白和因子與細胞共同組成交互的網(wǎng)狀結(jié)構，抵抗張力，使韌帶發(fā)揮作用。細胞外基質(zhì)是評價誘導效果的重要指標。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及Tenascin-c是人韌帶組織細胞外基質(zhì)中主要成分，所以也是誘導的主要目標蛋白。在韌帶組織工程學中，與Ⅰ型膠原相比更需要提高Ⅲ型膠原的表達，在正常的韌帶組織中Ⅲ型膠原蛋白的合成比Ⅰ型膠原的合成速度更快【44】。隨著研究的進展韌帶組織中的其他成分也逐漸被發(fā)現(xiàn)，這些蛋白和因子在韌帶合成、代謝中起到重要作用，主要有Elastin(彈性蛋白)、Fibronectin(纖維結(jié)合蛋白)、Biglycan(雙糖鏈蛋白聚糖)、Vimentin(波形蛋白)、α-SMA、MMP-2、TIMP-1、TGF-β1。Fibronectin具有可以促進纖維蛋白聚集，在細胞粘附和細胞外基質(zhì)交互連接時起到重要作用【45】。Elastin通過使彈性原蛋白交叉相連形成韌帶組織的抗拉能力【46】。MMP-2可以促進膠原遷移，參與了韌帶組織的重建、修復和基底膜的降解等過程【47】。因此這些非膠原蛋白和因子對于韌帶的構建起到了重要作用，目前的研究中對于這些蛋白和因子的檢測也越來越多，使細胞外基質(zhì)的研究內(nèi)容越來越廣泛，對細胞的誘導效果評價越來越系統(tǒng)。

力學誘導對細胞和細胞外基質(zhì)的結(jié)構重建起到重要作用，隨著力學誘導的研究深入，細胞的形態(tài)和細胞的沿受力方向排列情況逐漸受到重視，被作為細胞構建韌帶結(jié)構的誘導效果，是韌帶組織工程學中的關鍵指標，韌帶的構建需要細胞和細胞外基質(zhì)的交互構建，在人韌帶結(jié)構中細胞的形態(tài)多是沿韌帶走行的長梭形細胞，所以在韌帶組織工程學中，種子細胞的形態(tài)和細胞排列也需要沿韌帶走行分布，這一誘導結(jié)果是生物環(huán)境所不能達到的，需要力學環(huán)境誘導，也是力學環(huán)境誘導的一大優(yōu)勢。

以上三方面是目前韌帶組織工程學種子細胞誘導的主要評價指標，反映了種子細胞的活性、分化程度，是否滿足構建韌帶的需求，在韌帶構建中持續(xù)發(fā)揮作用。

4 展望

種子細胞的分選、誘導和評價在韌帶組織工程學中越來越重要，是未來組織工程學韌帶的基礎，隨著科研的發(fā)展，種子細胞也將不斷完善。iPS細胞的發(fā)展也會種子細胞提供一個非常好的候選者，基因工程的發(fā)展，為改變細胞的活性和促進細胞外基質(zhì)的合成等方面提供一個切實可行的并且有很大的研究前景的方法。力學刺激的發(fā)展，隨著對刺激環(huán)境的不斷改善，其對細胞的誘導作用會越來越明顯。目前雖然對韌帶構建中的各種蛋白和因子尚未完全明確其組成，相互作用關系以及對細胞的誘導作用，但相信隨著研究的深入，會得到更加符合韌帶組織工程學需要的種子細胞，滿足組織工程學韌帶的需要，為韌帶的構建奠定堅實的基礎。

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貴州省科學技術基金資助項目(NO:黔科合SY字【2010】2091)。

劉毅，男，主任醫(yī)師，研究方向：韌帶組織工程學及膝關節(jié)外科，E-mail:13308529536@163.com。

R686.5

A

1000-2715(2012)05-0458-06

【收稿2012-08-25；修回2012-09-12】

(編輯：王福軍)