楊夏茵，徐應(yīng)軍，張桂東

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病(冠心病)已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類生命的疾病之一，冠狀動(dòng)脈介入技術(shù)的應(yīng)用減少了患者心絞痛的癥狀發(fā)作，改善了患者的生活質(zhì)量，但卻無法根本改變動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的進(jìn)程。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和成熟，逐漸誕生了冠心病基因治療的新途徑。據(jù)統(tǒng)計(jì)，過去10年的基因治療的臨床病例中，有8%的病例是與冠心病治療相關(guān)，基因治療冠心病方面表現(xiàn)出了良好的效果［1］，如美國基因治療冠心病治愈率從1994年的3%升至2010年的17%［2］。隨著治愈率的增加，基因治療冠心病的類型也出現(xiàn)新的突破，已經(jīng)從原來的單基因遺傳的冠心病擴(kuò)展至多基因的心血管疾病，如高血壓和腦卒中等。冠心病的基因治療逐步顯現(xiàn)出光明的前景。

1 冠心病基因治療的相關(guān)領(lǐng)域

冠心病的基因治療涉及了治療冠心病的各個(gè)方面，如動(dòng)脈粥樣硬化的基因治療、血管生成的基因治療和血管成形術(shù)后再狹窄的基因治療等［3］。其中血管生成的基因治療目前發(fā)展最快，且已經(jīng)大量應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，可望成為未來疾病治療中最可行的領(lǐng)域。

1.1動(dòng)脈粥樣硬化的基因治療近年來研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化與內(nèi)膜損傷及炎癥機(jī)制密切相關(guān)，進(jìn)而發(fā)生一系列的細(xì)胞增殖、脂質(zhì)沉積以及斑塊形成等過程，最終導(dǎo)致典型的動(dòng)脈粥樣硬化。當(dāng)前動(dòng)脈粥樣硬化的治療研究還主要在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，在人體內(nèi)環(huán)境中的治療作用和效果尚未得到證實(shí)［4］。涉及的主要方面包括脂代謝異常及動(dòng)脈粥樣硬化形成機(jī)制(細(xì)胞損傷、細(xì)胞增殖和炎癥等)的干預(yù)及介入治療。主要是通過有治療作用的目的基因轉(zhuǎn)入患者相關(guān)器官或組織中，繼而目的基因在體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行適度的表達(dá)，以達(dá)到治療或延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的目的［5］。

1.2血管生成的基因治療血管再生機(jī)制以及血管生長(zhǎng)因子促血管生成作用的發(fā)現(xiàn)是近10年來的研究熱點(diǎn)，并在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。血管生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)新生血管再生和建立缺血組織的側(cè)支循環(huán)，對(duì)冠心病的治療效果有很大的促進(jìn)作用。在基礎(chǔ)和臨床研究中關(guān)注最多的生長(zhǎng)因子基因主要有:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因［6］、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)基因［7］、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因［8］、促血管生成因子-1基因等。血管再生基因治療主要目的是促進(jìn)缺血組織側(cè)支血液循環(huán)的建立，在治療冠心病中已顯示了良好的效果［9-10］。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和血管的發(fā)生，提高單層內(nèi)皮的通透性，在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。VEGF基因治療是上世紀(jì)90年代以來研究最有進(jìn)展的治療方法，在動(dòng)物體內(nèi)和人體內(nèi)進(jìn)行了一系列的研究和應(yīng)用，表明其具有增加血管的通透性、促進(jìn)血管生成、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降低心輸出量和每搏輸出量等作用［11-14］，目前已經(jīng)明確VEGF的基因治療可應(yīng)用于冠心病患者的治療，將來可能廣泛應(yīng)用于臨床。

FGF可刺激內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖;其促血管新生的主要作用在于促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)對(duì)基底膜有降解作用的蛋白酶的釋放及血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔［15］。FGF基因治療冠心病的有效性和研究熱度次于VEGF基因治療。FGF蛋白治療冠心病的效果較安慰劑的效果顯著增加，但轉(zhuǎn)入細(xì)胞的FGF基因表達(dá)后無法分泌至細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)功能，是其基因治療的一大缺陷。針對(duì)這一缺陷，有研究者通過引入信號(hào)肽使表達(dá)的FGF蛋白可分泌至細(xì)胞外，從而發(fā)揮功能［16］。這一做法成功地將FGF基因治療應(yīng)用于冠心病的臨床治療中。

HGF是由α亞基和β亞基通過二硫鍵而組成的異源二聚體，主要有三種:肝源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子?；A(chǔ)研究表明，通過腺病毒載體構(gòu)建表達(dá)HGF的病毒載體導(dǎo)入缺血大鼠心肌后，大鼠心肌缺血癥狀明顯改善［17］。另有研究，采用心臟缺血模型比較HGF和VEGF的功效發(fā)現(xiàn):①VEGF具有使血管通透性過強(qiáng)的副作用，而HGF不具有這一缺點(diǎn);②HGF具有更強(qiáng)的促血管再生功能。

促血管生成因子-1是RNA酶家族的一類蛋白，具有RNA酶活性的血管生成因子。通過血管微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)促血管生成因子-1較VEGF、FGF和HGF促進(jìn)的新生血管生成更完整，而VGEF促進(jìn)生成的新生血管的通透性增加［18］。促血管生成因子-1常與其他血管生成因子基因聯(lián)合治療，有研究將促血管生成因子-1和VEGF基因聯(lián)合使用，促血管生成因子-1的持久穩(wěn)定促血管生成功能和VEGF血管通透性過強(qiáng)可相互補(bǔ)充［19］。這一治療效果在大鼠下肢動(dòng)脈閉塞模型中得到證實(shí)。聯(lián)合治療方案將可能是未來血管生成因子-1基因治療重要選擇。

1.3血管成形術(shù)后再狹窄的基因治療血管成形術(shù)后再狹窄的問題是目前臨床上較難解決的問題，一直困擾著醫(yī)生。血管成形術(shù)后再狹窄的機(jī)制主要包括血管的彈性回縮、血管內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)。血管成形術(shù)后再狹窄的基因治療有三個(gè)層次:一是引入反義寡核苷酸阻斷蛋白質(zhì)合成，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖;二是導(dǎo)入外源性基因產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，促使細(xì)胞凋亡;三是構(gòu)建基因工程細(xì)胞減輕創(chuàng)傷反應(yīng)。從分子水平來看，血管成形術(shù)后內(nèi)膜的異常增生與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板粘附、局部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的增殖和遷移有關(guān)，涉及多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的作用以及各種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的異常表達(dá)，因此再狹窄的防治可從這些環(huán)節(jié)入手。2001至2002年，雷帕霉素涂層支架預(yù)防再狹窄的臨床試驗(yàn)取得了驚人的成功［20］，對(duì)血管再狹窄基因治療的研究有很大的沖擊，同時(shí)也提示尋找再狹窄發(fā)生發(fā)展過程中新的關(guān)鍵基因仍將是基因治療研究中的主要方面。由于血管內(nèi)膜增生在支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生中發(fā)揮主要作用，因此針對(duì)內(nèi)膜增殖的基因療法有可能對(duì)支架內(nèi)再狹窄的防治有較為顯著的療效。目前隨著對(duì)血管成形術(shù)后再狹窄生理機(jī)制研究的逐漸深入，以及治療基因、基因遞送系統(tǒng)和基因載體的進(jìn)一步發(fā)展完善，基因治療也可能成為防治血管成形術(shù)后再狹窄做出貢獻(xiàn)［21］。

2 基因治療冠心病的方法

2.1載體系統(tǒng)的選擇目前基因治療載體有兩類:病毒型和非病毒型載體。病毒型載體具有免疫原性，而且在體內(nèi)會(huì)引發(fā)安全隱患，需要進(jìn)行反復(fù)認(rèn)證或者官方認(rèn)證才能得到應(yīng)用。非病毒型載體雖然安全可靠，但其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的效率即轉(zhuǎn)染效率低而影響基因治療效果。冠心病臨床試驗(yàn)或基礎(chǔ)研究采用的基因載體主要有質(zhì)粒和腺病毒。質(zhì)粒屬于非病毒載體，是包括啟動(dòng)子、中止信號(hào)的雙螺旋DNA。由于螺旋DNA轉(zhuǎn)染效率會(huì)很低，因此在做基因治療時(shí)需要借助不同的轉(zhuǎn)染方法或?qū)胪緩竭M(jìn)行實(shí)施，其免疫原性低不會(huì)產(chǎn)生免疫抵抗而被應(yīng)用于冠心病的治療。與腫瘤治療不同，冠心病中不再重視病毒型載體的治療，裸露的DNA質(zhì)粒治療被廣泛應(yīng)用。FDA的一項(xiàng)報(bào)道中得出，冠心病基因治療中的39%的治療方案是采用的質(zhì)粒載體［22］。雖然病毒型載體雖有免疫原性和安全等問題，但是迄今為止有仍有53%臨床亞牛應(yīng)用腺病毒載體進(jìn)行VEGF等基因治療，且并未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。因此在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，病毒型載體在心血管病，包括冠心病的基因治療中還將占有較大的比重。

2.2目的基因的導(dǎo)入方法基因?qū)肟梢允峭ㄟ^載體將目的基因直接導(dǎo)入受體心肌，也可以是通過載體首先導(dǎo)入體外培養(yǎng)的自體或異體細(xì)胞，再將表達(dá)有外源目的基因的細(xì)胞回輸給受者。目前冠心病的基因治療主要是選擇將目的基因直接導(dǎo)入受體心肌。常用的方法和技術(shù)手段主要有靜脈注射法、冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注法、心肌內(nèi)注射法、心包轉(zhuǎn)移法等［5］。靜脈注射法是最簡(jiǎn)便的方法，但組織特異性差，載體用量較大，會(huì)導(dǎo)致外源基因進(jìn)入非靶器官;冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注法操作簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小，直接通過股動(dòng)脈穿刺，插入造影導(dǎo)管達(dá)冠狀動(dòng)脈竇口后將攜有目標(biāo)基因的載體注入，此方法不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，但仍然會(huì)造成基因隨血行播散至細(xì)胞外組織造成非特異性表達(dá);心肌內(nèi)注射法具有一定的特異性，操作失敗的風(fēng)險(xiǎn)較大，目前較少應(yīng)用;心包轉(zhuǎn)移法與心肌內(nèi)注射法類似，目前在臨床上應(yīng)用較少。

3 總結(jié)與展望

冠心病的基因治療研究已經(jīng)取得了令人矚目的進(jìn)展，但仍存在很多需要深入研究的問題，如治療基因的選擇和篩選、載體的選擇、疾病機(jī)制與基因治療的關(guān)聯(lián)性研究、載體導(dǎo)入途徑的研究等。而對(duì)于已經(jīng)構(gòu)建的載體，還需要探討載體安全性、載體劑量、導(dǎo)入途徑和治療方案等問題。尋找新的治療基因、更理想的基因載體、更安全有效的基因轉(zhuǎn)移途徑仍然是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)，而與其它傳統(tǒng)或新興的治療手段的結(jié)合也將是基因治療在臨床應(yīng)用的重要方式。

［1］劉炯鷗，賀立新.內(nèi)蒙古地區(qū)漢族冠心病患者的ACE基因研究［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，(10):23-24.

［2］Kolsut P，Malecki M，Zelazny P，et al.Gene therapy of coronary artery disease with phvegf165--early outcome［J］.Kardiol Pol，2003，59(11):373-384.

［3］Chaer RA，Billeh R，Massad MG.Genetics and gene manipulation therapy of premature coronary artery disease［J］.Cardiology，2004，101(1-3):122-130.

［4］Wilson JM，Grossman M.Therapeutic strategies for familial hypercholesterolemia based on somatic gene transfer［J］.Am J Cardiol，1993，72(10):59D-63D.

［5］田然，張抒揚(yáng).冠狀動(dòng)脈粥狀硬化性心臟病的基因治療［J］.中國醫(yī)藥，2006，1(11):702-704.

［6］Ripa RS，Jorgensen E，Baldazzi F，et al.The influence of genotype on vascular endothelial growth factor and regulation of myocardial collateral blood flow in patients with acute and chronic coronary heart disease［J］.Scand J Clin Lab Invest，2009，69(6):722-728.

［7］Stegmann TJ，Hoppert T，Schneider A，et al.Induction of myocardial neoangiogenesis by human growth factors.A new therapeutic approach in coronary heart disease［J］.Herz，2000，25(6):589-599.

［8］Kazberuk W，Pawlak K，Mysliwiec M.Hepatocyte growth factor(HGF)in stable and unstable coronary heart disease［J］.Pol Arch Med Wewn，2003，110(5):1283-1288.

［9］李宏.血管生成基因治療冠心?。跩］.赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，23(5):107-120.

［10］尹瑞興.冠心病血管生成治療的研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代臨床雜志，2009，7(2):128-133.

［11］Penumathsa SV，Maulik N.Resveratrol:a promising agent in promoting cardioprotection against coronary heart disease［J］.Can J Physiol Pharmacol，2009，87(4):275-286.

［12］Shen F，F(xiàn)an Y，Su H，et al.Adeno-associated viral vector-mediated hypoxia-regulated VEGF gene transfer promotes angiogenesis following focal cerebral ischemia in mice［J］.Gene Ther，2008，15(1):30-39.

［13］Henry TD，Annex BH，McKendall GR，et al.The VIVA trial:Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis［J］.Circulation，2003，107(10):1359-1365.

［14］Losordo DW，Vale PR，Hendel RC，et al.Phase 1/2 placebo-controlled，double-blind，dose-escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia［J］.Circulation，2002，105(17):2012-2018.

［15］魏建明，王衛(wèi)群.促血管生成治療冠心病的研究進(jìn)展［J］.國際內(nèi)科學(xué)雜志，2007，34(1):14-16.

［16］張書蘭，楊志健，張友榮，等.腺病毒轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)冠心病患者外周造血干細(xì)胞的動(dòng)員作用［J］.中華心血管病雜志，2007，35(6):504-508.

［17］楊輝，王鵬，高峰.構(gòu)建疼痛基因腺病毒載體感染體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞［J］.中國臨床康復(fù)，2005，(17):43-45.

［18］林安華，雷閩湘，謝曉蕓，徐寒松.糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中促血管生成因子的表達(dá)及意義［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，(12):1243-1250.

［19］吳志華，劉鐵英.子宮頸癌組織中促血管生成因子的表達(dá)及其與新生血管形成的關(guān)系［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2003，38(1):44-45.

［20］沈靚，王若琦，高路.雷帕霉素涂層支架臨床研究進(jìn)展［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2005，8(8):677-678.

［21］俞夢(mèng)越，高潤(rùn)霖.經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)后再狹窄的基因治療研究進(jìn)展［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81(1):50-52.

［22］Isner JM，Vale PR，Symes JF，Losordo DW.Assessment of risks associated with cardiovascular gene therapy in human subjects［J］.Circ Res，2001，89(5):389-400.