張敏慧，韓彥青，李光來，李東芳，裴宇恒

慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion）是神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的病理狀態(tài)，多項(xiàng)基礎(chǔ)與臨床研究都顯示無論是阿爾茲海默?。ˋD）還是血管性癡呆（VaD）都存在不同程度的慢性腦低灌注。目前對(duì)慢性腦低灌注導(dǎo)致認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙的機(jī)制尚不完全清楚。近年來有報(bào)道，炎性免疫反應(yīng)在癡呆等慢性缺血性腦血管病方面有重要作用。近年發(fā)現(xiàn)，在干擾素（IFN－γ）作用下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞都能表達(dá)吲哚胺－2，3－雙加氧酶（indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO），在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要作用［1］。

本實(shí)驗(yàn)采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)模型（2VO）模擬慢性低灌注狀態(tài)，用Morris水迷宮檢測(cè)2VO大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力變化，通過觀察大鼠海馬IFN－γ、IDO的表達(dá)，探討IDO在慢性腦低灌注導(dǎo)致認(rèn)知功能損害炎性發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 成年健康雄性 Wistar大鼠36只，體質(zhì)量（203．8±7．8）g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，在具有通風(fēng)設(shè)備的動(dòng)物房?jī)?nèi)籠養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)前后過程中均給予充足的水及食物。隨機(jī)分成假手術(shù)組與模型組，各18只。

1．2 動(dòng)物模型的制備 參照 Wakita等［2］的方法進(jìn)行2VO模型制備。大鼠于術(shù)前12h禁食，4h禁水。10%水合氯醛（350 mg／kg體重）腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥固定，行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用4號(hào)手術(shù)線行雙重結(jié)扎。術(shù)后縫合切口并連續(xù)3d肌肉注射2×105U青霉素鈉，放回籠中保溫（26℃）飼養(yǎng)。對(duì)照組處理步驟同上，但不進(jìn)行頸總動(dòng)脈結(jié)扎。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中。模型組大鼠死亡3只，假手術(shù)組大鼠全部存活。

1．3 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試 動(dòng)物模型制備4周后行水迷宮測(cè)試，實(shí)驗(yàn)參照Vorhees等［3］總結(jié)的方法進(jìn)行，主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)2個(gè)部分。定位航行實(shí)驗(yàn)：連續(xù)訓(xùn)練5d，每天上午、下午2個(gè)時(shí)段，每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練3次，分別從3個(gè)象限入水。發(fā)現(xiàn)平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立30s，將大鼠從平臺(tái)上拿下來休息60s，再隨機(jī)由下一象限入水進(jìn)行試驗(yàn)，如果120 s內(nèi)找不到平臺(tái)，則由操作者幫助其上平臺(tái)，潛伏期記為最高分120s。記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。每天計(jì)算其平均數(shù)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力，定位航行實(shí)驗(yàn)后，即在第6天上午，撤除水下平臺(tái)，取任意1個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測(cè)定其120s內(nèi)在平臺(tái)象限的游泳距離占總距離的百分比（distance percentage，DP）。

1．4 取海馬 各組大鼠行為觀察結(jié)束后，將大鼠麻醉后斷頭處死，迅速剝離腦組織，沿視交叉前端作冠狀切面，立即在冰盒上無菌分離出海馬組織，置－70℃冰箱／10%多聚甲醛中備用。

1．5 IDO的檢測(cè) 海馬組織和生理鹽水1∶9比例冰上勻漿，將海馬研磨成勻漿，3 500r／min離心10min，取上清液。試驗(yàn)中采用IDO試劑盒檢測(cè)，采用比色法在酶標(biāo)板上反應(yīng)。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，第1管加蒸餾水950μL，第2～8管加入蒸餾水500 μL，在第1管中加入100ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL，混勻后加樣器吸出500μL，移至第2管，如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋，從第7管中吸出500μL棄出，第8管為空白對(duì)照。每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品20μL。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)15min。每孔加入100μL終止液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IDO與底物工作液顯色30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值（OD）。IDO濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IDO濃度。

1．6 免疫組織化學(xué)法 觀察INF－γ的表達(dá)：大鼠海馬組織經(jīng)4℃的4%多聚甲醛72h充分固定后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備厚4μm組織切片。切片經(jīng)脫蠟至水化，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗；枸櫞酸鹽緩沖液，微波熱修復(fù)20min，PBS洗滌；5%BSA封閉20min，傾去；滴加適當(dāng)稀釋的一抗4℃過夜，PBS緩沖液洗滌；滴加兔抗大鼠二抗37℃反應(yīng)30min，PBS緩沖液洗滌；滴加試劑SABC，PBS洗滌；DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素－伊紅復(fù)染，脫水，透明，封片。選取海馬區(qū)CA1區(qū)，將切片在OLYMPUS BX51正置熒光顯微鏡下觀察，采用Image－Pro plus圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，以陽性細(xì)胞的平均光密度值表示IFN的表達(dá)水平。免疫組化染色結(jié)果判定：胞漿呈棕黃色為陽性細(xì)胞。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2VO大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力下降。水迷宮結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，平臺(tái)象限游泳距離百分比減少（P＜0．05）；隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，兩組大鼠的學(xué)習(xí)能力均有提高，但模型組逃避潛伏期仍長(zhǎng)于假手術(shù)組（P＜0．05）。詳見表1、表2。

表1 兩組大鼠每天平均逃避潛伏期測(cè)試結(jié)果（±s） s

表1 兩組大鼠每天平均逃避潛伏期測(cè)試結(jié)果（±s） s

組別 鼠數(shù) 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手術(shù)組 18 96．11±2．58 77．49±1．72 52．94±1．24 24．13±1．38 13．88±0．83模型組 15 103．16±2．37 90．94±2．06 71．02±2．021） 42．33±1．491） 30．99±1．831）與假手術(shù)組比較，1）P＜0．05

表2 兩組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)平臺(tái)象限游泳距離百分比比較（±s） %

表2 兩組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)平臺(tái)象限游泳距離百分比比較（±s） %

組別 鼠數(shù) 游泳距離假手術(shù)組 18 50．51±4．01模型組 15 24．80±3．061）與假手術(shù)組比較，1）P＜0．05

2．2 海馬INF－γ、IDO的表達(dá) 模型組海馬組織IDO表達(dá)、INF－γ陽性細(xì)胞累計(jì)光密度值高于假手術(shù)組（P＜0．05）。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)IFN－γ平均光密度值、IDO的表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)IFN－γ平均光密度值、IDO的表達(dá)比較（±s）

組別 鼠數(shù) IFN－γ IDO濃度（ng／mL）假手術(shù)組 18 0．14±0．04 0．89±0．06模型組 15 0．50±0．031） 4．73±0．211）與假手術(shù)組比較，1）P＜0．05

3 討 論

慢性腦缺血是各種原因引發(fā)的長(zhǎng)期慢性腦血流灌注不足導(dǎo)致的以持久或進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的一組疾病，是血管性癡呆、Alzheimer病、Binswanger病等多種疾病的共同病理基礎(chǔ)，主要的損傷機(jī)制有凋亡、免疫炎性損傷、氧化應(yīng)激損傷、突觸結(jié)構(gòu)和功能異常、能量代謝障礙、中樞膽堿能及單胺能系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂等［4］。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型采用較為常用的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎，保證鼠腦不完全性缺血，與人類慢性腦低灌注相似。通過水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了模型大鼠存在學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。

吲哚胺－2，3－雙加氧酶是IFN－γ誘導(dǎo)表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)的一種酶。參與許多疾病的免疫調(diào)節(jié)，如自身免疫反應(yīng)性疾病、腫瘤的免疫逃避以及移植免疫。研究證實(shí)，正常生理?xiàng)l件下IDO活性很低。當(dāng)在病毒細(xì)菌感染、炎性反應(yīng)刺激的條件下，IFN－γ分泌增加，可刺激IDO表達(dá)增強(qiáng)，IDO誘導(dǎo)產(chǎn)生的毒性化合物是AD發(fā)病機(jī)制中的重要成分［5］。Gold等［6］認(rèn)為卒中后認(rèn)知障礙炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)是IDO與犬尿氨酸代謝產(chǎn)物增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠IFN－γ增高，說明慢性腦灌注大鼠的病理生理過程包含著炎性反應(yīng)，而炎性反應(yīng)的發(fā)生很可能刺激了IDO的高表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠IFN－γ增高，說明慢性腦灌注大鼠的病理生理過程包含著炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)的發(fā)生刺激了IDO的高表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、死亡。這可能為使用IDO抑制劑抑制致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而減輕腦微血管免疫炎癥，將為預(yù)防和治療VCI提供新思路。

［1］Godin－Ethier J，Hanafi LA．Indoleamine 2，3－dioxygenase expression in human cancers：Clinical and immunologic perspectives［J］．Clin Cancer Res，2011，17（22）：6985－6991．

［2］Wakita H，Tomimoto H，Akiguehi I．Protective effect of cyclosporin a on white matter changes in the rat brain after chronic cerebral hypoperfusion［J］．Stroke，1995，26（8）：1415－1422．

［3］Vorhees CV，Williams MT．Morris water maze：Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］．Nat Protoc，2006，1：848－858．

［4］劉暉，章軍建，楊英，等．慢性腦低灌注對(duì)大鼠皮層核因子E2相關(guān)因子2表達(dá)的影響［J］．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（1）：6－9．

［5］Bonda DJ，Mailankot M，Stone JG．Indoleamine 2，3－dioxygenase and 3－h(huán)ydroxykynurenine modifications are found in the neuropathology of Alzheimer’s disease［J］．Redox Rep，2010，15（4）：161－168．

［6］Gold AB，Herrmann N，Swardfager W，et al．The relationship between indoleamine 2，3－dioxygenase activity and post－stroke cognitive impairment［J］．Neuroinflammation，2011，2（16）：8－17．