李 鵬，宋楠楠，岳盈盈，李志會(huì)，張 穎，蓋中濤，孟 紅

腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是引起嬰幼兒手足口?。℉and Foot and Mouth Disease，HFMD）的主要病原之一，其感染可導(dǎo)致部分患者無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、脊髓灰質(zhì)炎樣癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，死亡率較高［1］。我國(guó)2008年安徽阜陽出現(xiàn)EV71手足口病暴發(fā)，近幾年各地的手足口病疫情不斷加劇［2］。目前重癥EV71手足口病的嗜神經(jīng)性致病機(jī)制仍不明確，EV71毒力決定因子也未確定，給EV71的防治帶來很大困難。為探討序列變異對(duì)EV71流行和毒力變化的影響及目前濟(jì)南流行株的遺傳學(xué)背景，本研究對(duì)濟(jì)南市兩株分別源自輕癥和重癥手足口病人的EV71分離株進(jìn)行全基因組序列的測(cè)定和比較分析，為EV71致病機(jī)制和嗜神經(jīng)性毒力位點(diǎn)的研究提供參考。

1 材料與方法

1．1 毒株 EV71JN200803株，分離自2008年濟(jì)南市傳染病醫(yī)院僅患有皮疹的手足口病患者糞便標(biāo)本，接種1日齡BALB／c小鼠無明顯臨床癥狀；EV71JN200804株，分離自2008年濟(jì)南市傳染病醫(yī)院患有無菌性腦膜炎手足口病患者的糞便標(biāo)本，接種1日齡BALB／c小鼠可導(dǎo)致后肢麻痹，死亡。

1．2 試劑 RNA提取采用德國(guó)QIAGEN公司病毒RNA提取試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit），cDNA第一鏈合成試劑盒（QuantScript RT Kit）、高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase）及凝膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit）均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1．3 引物 根據(jù)EV71安徽阜陽株（EU703812）并參考BrCr株全基因組序列，利用Primer5．0設(shè)計(jì)擴(kuò)增EV71全基因組核苷酸序列引物，9對(duì)引物首尾相互重疊、覆蓋全基因組，見表1。

表1 PCR擴(kuò)增用引物序列Tab．1 Primers used in PCR amplification

1．4 病毒總RNA的提取 把EV71JN200803、JN200804株經(jīng)MA104細(xì)胞擴(kuò)增得到的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，12 000g離心5min，取上清液140μL按RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1．5 RT－PCR 采用cDNA第一鏈合成試劑盒，將病毒總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物于25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30s，N 30s，72℃1min，40 Cycles（N為退火溫度，各引物不同）；72℃10min。PCR擴(kuò)增的特異性片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收后送公司測(cè)序、拼接。

1．6 全基因組序列的比對(duì) 采用clustalx1．83對(duì)EV71JN200803和JN200804的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，找出兩株病毒在核苷酸和氨基酸序列上的差異。

1．7 非編碼區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 采用RNAstructure5．3對(duì)EV71JN200803和JN200804株5′UTR和3′UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其差異進(jìn)行分析。

1．8 遺傳進(jìn)化分析 采用 MEGA5．05軟件對(duì)EV71JN200803和JN200804株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，將其與國(guó)內(nèi)外各型EV71毒株的發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究。

2 結(jié) 果

2．1 全基因組序列測(cè)定分析 不包含多聚腺苷酸尾EV71JN200803株全基因組長(zhǎng)度為7 405nt，EV71JN200804株全基因組長(zhǎng)度為7 404nt。JN200803株 5′端非編碼區(qū)（5′UTR）為 742nt，JN200804株為741nt；兩毒株基因組編碼區(qū)均為6582nt，編碼2193個(gè)氨基酸的多聚蛋白（Polyprotein）；3′端非編碼區(qū)（3′UTR）均為81nt。JN200803和JN200804株病毒基因組的組成和結(jié)構(gòu)均符合EV71的特征。測(cè)定的全基因組序列已上傳至GENEBANK，EV71JN200803和JN200804株的序列登記號(hào)分別為：JF913464和HQ825317。

2．2 兩株EV71核苷酸和氨基酸序列差異分析EV71JN200803和JN200804株非編碼區(qū)核苷酸序列比較發(fā)現(xiàn)，5′UTR共有7個(gè)核苷酸的差異，除99位JN200804株缺失1個(gè)胞嘧啶核苷酸（C）外，其余6個(gè)均為核苷酸的轉(zhuǎn)換；3′UTR只有7347位1個(gè)核苷酸的發(fā)生轉(zhuǎn)換，見表2。EV71JN200803和JN200804株編碼區(qū)核苷酸及氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，二者在編碼區(qū)沒有核苷酸的缺失和插入，共有98個(gè)核苷酸的差異，且突變類型全都屬于轉(zhuǎn)換，但大部分核苷酸的突變屬于同義突變，僅有16個(gè)造成了氨基酸的改變；16個(gè)突變氨基酸的分布為，VP3 3個(gè)，VP1 1個(gè)，2A1 個(gè)，2B3 個(gè)，2C4 個(gè) ，3C2 個(gè) ，3D2個(gè)，而VP4、VP2、3A和3B氨基酸沒有發(fā)生突變，表3。

表2 兩株EV71非編碼區(qū)序列比較結(jié)果Tab．2 Comparision of noncoding regions in JN200803 and JN200804

表3 兩株EV71編碼區(qū)序列比較結(jié)果Tab．3 Comparision of the coding regions in JN200803and JN200804

2．3 兩株EV71非編碼區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)差異分析EV71 5′UTR第453～561位堿基（BrCr株堿基位置）區(qū)與脊髓灰質(zhì)炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）第Ⅵ結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)，該區(qū)被認(rèn)為同脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）的毒力密切相關(guān)［3］。然而EV71JN200803和JN200804株在此區(qū)核苷酸序列完全相同，表明造成二者毒力差別的毒力決定位點(diǎn)可能并不在5′UTR。采用RNAStructure5．3對(duì)3′UTR進(jìn)行了RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。從圖1可以看到EV71JN200803和JN200804株二級(jí)結(jié)構(gòu)僅3′UTR第23位（基因組7347位）與第52位（基因組7376位）堿基配對(duì)有差異，JN200803的 G－T不能形成穩(wěn)定的配對(duì)，而JN200804的A－T的配對(duì)很穩(wěn)定。JN200804株形成二級(jí)結(jié)構(gòu)所需自由能低于JN200803株，毒力較強(qiáng)的JN200804株的二級(jí)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

圖1 JN200803和JN200804株3′UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig．1 Computer－predicted secondary structures of EV71 3′UTR of JN200803and JN200804Note：ΔG of JN200803and JN200804were﹣25．4 kcal／mol and﹣25．8kcal／mol，respectively

2．4 兩株EV71的遺傳進(jìn)化分析 采用MEGA5．05軟件，通過鄰接法（Neighbor－joining），以柯薩奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CVA16）為外群，對(duì)EV71JN200803、JN200804及GenBank中各亞型EV71的VP1及全基因組核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析（圖2，圖3）。可見JN200803和JN200804株與Fuyang／17．08／1株進(jìn)化關(guān)系最近，同屬于C4基因亞型的C4a進(jìn)化分支。2008年國(guó)內(nèi)主要的EV71流行株進(jìn)化關(guān)系非常密切，與國(guó)外EV71毒株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討 論

圖2 EV71VP1區(qū)的遺傳進(jìn)化分析Fig．2 Phylogenetic tree of VPl regions in EV71

圖3 EV71全基因組核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析Fig．3 Phylogenetic tree of complete genomic nucleotide sequences in EV71

EV71進(jìn)化過程中的基因突變是造成毒力改變的主要因素之一。McMinn等［4］發(fā)現(xiàn)EV71澳大利亞流行株中只表現(xiàn)HFMD與具有神經(jīng)毒性分離株的主要區(qū)別在于VP1第170氨基酸從丙氨酸（Ala）突變 為 纈 氨 酸 （Val）。Fujimoto 等［5］發(fā) 現(xiàn) 日 本Hyogo地區(qū)表現(xiàn)為腦干腦炎EV71毒株的VP4基因序列均一致，與表現(xiàn)為手足口病EV71毒株有較大差異。Shih等［6］比較了致死和非致死病例感染的EV71的基因組全序列，發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白3C區(qū)域的核苷酸序列存在較大差異。Chang等［7］對(duì)中國(guó)6株不同毒力EV71分離株全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，3株臨床輕癥分離株與3株臨床重癥分離株唯一相同的差別是第1994位氨基酸（3D區(qū)）由纈氨酸（Val）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）。Wang等［8］將實(shí)驗(yàn)鼠感染不致病EV71毒株4643與具有神經(jīng)嗜性突變毒株MP4進(jìn)行全基因組序列分析，結(jié)果MP4 5′UTR區(qū)有4個(gè)核苷酸突變。

本文兩株不同毒力EV71的全基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)有16個(gè)氨基酸發(fā)生了突變，其中VP3 3個(gè)，VP1 1個(gè)，2A1個(gè)，2B3個(gè)，2C4個(gè)，3C2個(gè)，3D2個(gè)，而VP4、VP2、3A和3B氨基酸未發(fā)生突變。其中3D區(qū)的突變與中國(guó)其他省EV71輕重株（重株：安徽1株、河南2株，輕株：重慶3株）氨基酸突變不同［7］，JN200803和JN200804株第1994位氨基酸均為異亮氨酸（Ile），與重慶的3株輕株相同。VP3、2A、2B和2C區(qū)雖然在已有報(bào)道中不是常見的毒力決定區(qū)域，但也可能存在對(duì)病毒毒力有影響的位點(diǎn)，Whitton等［9］發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒VP3第91位氨基酸對(duì)病毒致病性具有重要意義。因而EV71毒力決定位點(diǎn)不但具有非單一性，而且具有明顯的區(qū)域獨(dú)特性，與當(dāng)?shù)氐牧餍刑攸c(diǎn)密切相關(guān)。

小 RNA 病毒科 （picornaviridae）病 毒 的5′UTR有一個(gè)與翻譯密切相關(guān)的IRES，EV71與脊髓灰質(zhì)炎病毒的IRES為同一類型，結(jié)構(gòu)與功能極為相似［10］。脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES的第Ⅵ結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為與其毒力密切相關(guān)，而JN200803和JN200804株在此區(qū)域核苷酸序列完全相同，可見EV71濟(jì)南分離株的毒力決定位點(diǎn)可能不在5′UTR。EV71 3′UTR被認(rèn)為與病毒負(fù)鏈合成相關(guān)，對(duì)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有重要的調(diào)控作用，而EV71 JN200803和JN200804株3′UTR只有一個(gè)核苷酸的不同，分析發(fā)現(xiàn)JN200804株的二級(jí)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，對(duì)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制更為有利。

通常認(rèn)為VPl區(qū)全長(zhǎng)核苷酸序列分析可作為腸道病毒屬血清型分類的依據(jù)［11］。本文將EV71濟(jì)南分離株與2008年國(guó)內(nèi)主要流行株及其他亞型EV71進(jìn)行了VP1和全基因組遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)兩株EV71濟(jì)南分離株同屬C4亞型的C4a進(jìn)化分支，與Fuyang／17．08／1株進(jìn)化關(guān)系最近，應(yīng)具有共同的起源。另外，中國(guó)大陸1998年以來的EV71毒株均為C4亞型，2008年的分離株均為C4亞型的C4a進(jìn)化分支；與國(guó)外病毒株相比，中國(guó)大陸EV71分離株與中國(guó)臺(tái)灣分離株的親緣關(guān)系更近?？傊?，對(duì)相同疫源中不同毒力EV71分離株（EV71 JN200803和JN200804株）的全基因組序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)潛在的毒力決定位點(diǎn)，分析EV71的變異情況和流行特點(diǎn)，對(duì)EV71手足口病的防治具有重要意義。

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