陳 碩，邱少富，夏力亮，王中強(qiáng)，劉 軍，柳 楠，祝令偉，孫 洋，宋宏彬，馮書章

NDM－1最先報(bào)道于2010年8月11日，英國(guó)醫(yī)學(xué)界宣稱南亞出現(xiàn)了一種新型細(xì)菌，幾乎對(duì)所有抗生素都有抗藥性，被稱為“超級(jí)細(xì)菌”。確切地說(shuō)，NDM－1不是一種細(xì)菌，而是一種新發(fā)現(xiàn)的基因blaNDM－1編 碼 的 金 屬－β－內(nèi) 酰 胺 酶 （metallo－β－lactamase，MBL）。因?yàn)槭状尾±窃谟《刃碌吕镝t(yī)院住過(guò)院的瑞士人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，所以一些西方醫(yī)學(xué)者把它叫做“新德里金屬－β－內(nèi)酰胺酶1（New Delhi metallo－β－lactamase－1，NDM－1）”。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，攜帶編碼blaNDM－1基因的耐藥質(zhì)粒不僅可以在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，而且能使所在宿主菌成為可以耐受幾乎全部抗生素的超級(jí)細(xì)菌［1］。攜帶此酶的菌株對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類等β－內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素均耐藥，僅對(duì)多黏菌素及米諾環(huán)素衍生物—替加環(huán)素敏感［2］。由于該基因多定位于質(zhì)粒，容易通過(guò)接合性轉(zhuǎn)導(dǎo)在不同細(xì)菌間傳遞，一旦病原菌獲得該基因，也會(huì)產(chǎn)生多重耐藥表型，其感染將變得更加難以治療。據(jù)報(bào)道，新德里的這位病人就同時(shí)感染了攜帶blaNDM－1基因質(zhì)粒的肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌［3］。目前，這種可移動(dòng)元件攜帶的高水平廣譜抗性的發(fā)展趨勢(shì)引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。

本研究菌株NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌分離自廈門某醫(yī)院一肺癌病人，從其痰培養(yǎng)分離出多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，并檢出NDM－1。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌株的耐藥譜進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其blaNDM－1基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及序列分析，研究其耐藥性的分子機(jī)制，為耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌、E．coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；DL2000DNA Marker、質(zhì)粒pMD18－T購(gòu)自大連寶生物公司。凝膠回收試劑盒購(gòu)自杭州維特潔生物公司；Vitek32微生物鑒定系統(tǒng)為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；美洛培南為浙江海正制藥廠生產(chǎn)。

1．2 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌菌株鑒定與藥敏實(shí)驗(yàn) 使用Vitek32微生物鑒定系統(tǒng)，以革蘭陰性菌鑒定卡GNI＋進(jìn)行菌株鑒定，藥敏卡GNS－506進(jìn)行耐藥譜測(cè)定。

1．3 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌blaNDM－1基因的 PCR擴(kuò)增與克隆 根據(jù) GenBank的blaNDM－1基因（pKpANDM－1，登錄號(hào)FN396876．1）編碼序列設(shè)計(jì)兩條引物 LE－F：5′－GGCGTTAGATTGGCTTACACCATTAGAG－3′和 LE－R：5′－CAGGCAACAGCCGAACGAGC－3′，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA為模板，按照以下條件擴(kuò)增blaNDM－1基因：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將其與pMD18－T載體于4℃過(guò)夜連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E．coli DH5α，涂布于含氨芐青霉素（100μg／mL）的LB平板篩選。挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD18－T：：blaNDM－1送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1．4 美洛培南對(duì)NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌、重組E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）及大腸桿菌 E．coli DH5α最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定 將菌液過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋1 000倍，每孔100μL。美洛培南濃度從1孔至14孔分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．062 5、0．031 25、0．015 625μg／mL，15孔不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照。密封，35℃溫箱培養(yǎng)16～20h。判斷標(biāo)準(zhǔn)以孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。

2 結(jié) 果

2．1 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌菌株鑒定與藥敏結(jié)果Vitek32微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定此菌株為鮑曼不動(dòng)桿菌。藥敏結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌廈門株藥敏結(jié)果Tab．1 The antimicrobial susceptibility profile of NDM－1 Acinetobacter baumannii

2．2 NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌blaNDM－1基因的PCR擴(kuò)增、克隆與序列分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖1所示，結(jié)果擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的片段。blaNDM－1基因克隆到pMD18－T載體后進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，說(shuō)明blaNDM－1基因已克隆到載體中。

圖1 PCR擴(kuò)增 NDM－1（廈門株）blaNDM－1基因Fig．1 Amplification of blaNDM－1M：DL2000DNA Marker；1：PCR products

測(cè)序結(jié)果與香港分離的大腸桿菌HK－01質(zhì)粒pNDM－HK及印度肺炎克雷伯氏菌 KP－05－506質(zhì)粒pKpANDM－1攜帶的blaNDM－1基因進(jìn)行Blast序列比對(duì)。結(jié)果顯示，NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌與HK－01的blaNDM－1基因序列同源性為100%；與 KP－05－506相比，在blaNDM－1和trpF之間有24bp的插入，這一段插入的序列除了存在于香港HK－01株外，還存在于 NDM－1大腸桿菌 DVR22（西班牙株）、NDM－1大腸桿菌271（澳大利亞株）、NDM－1銅綠假單胞菌（塞爾維亞株）、NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌161／07（德國(guó)株）和 NDM－1大腸桿菌 Dok01（日本株），該段序列均位于blaNDM－1基因下游，功能未知。序列比對(duì)結(jié)果如下。

圖2 EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD18－T：：blaNDM－1Fig．2 Identification of plasmid pMD18－T：：blaNDM－1by restriction enzyme digestionM：DL2000DNA Marker；2：plasmid fragments digested by EcoRI and HindⅢ

2．3 最小抑菌濃度的測(cè)定 美洛培南對(duì)NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌、E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）及大腸桿菌E．coli DH5α最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果為NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌廈門株：128μg／mL；E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）：32μg／mL；E．coli DH5α：0．03125μg／mL。

3 討 論

金屬－β－內(nèi)酰胺酶基因可通過(guò)染色體和轉(zhuǎn)移基因在不同細(xì)菌間傳遞，造成廣泛耐藥，多種重要的獲得性 MBLs（IMP，VIM，SPM，GIM，SIM）都是由質(zhì)粒介導(dǎo)和可轉(zhuǎn)移基因編碼［4］。獲得性 MBLs不僅分布于腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌中，還可通過(guò)質(zhì)?；蛘献釉诓煌?、種屬間傳播［5］，因此產(chǎn)獲得性MBLs的革蘭陰性桿菌被公認(rèn)為極其重要的多重耐藥病原體［6］，給感染性疾病的臨床治療帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類等β－內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素均耐藥，對(duì)氨基糖苷類抗生素及喹諾酮類抗生素敏感。β－內(nèi)酰胺類是處理嚴(yán)重傳染病中主要的抗生素，與碳?xì)涿瓜╊惪股貐f(xié)同應(yīng)用效果更好，由于碳?xì)涿瓜╊愒趥魅静≈委熒洗罅渴褂?，是?dǎo)致超廣譜β－內(nèi)酰胺酶在腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生和擴(kuò)散的主要原因［6］。

本實(shí)驗(yàn)將NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌編碼碳青霉烯酶的blaNDM－1結(jié)構(gòu)基因及其上下游調(diào)控序列克隆轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E．coli DH5α。序列分析結(jié)果表明，該菌株blaNDM－1基 因 與 NDM－1 大 腸 桿 菌 香 港 株blaNDM－1基因序列同源性為100%，其結(jié)構(gòu)基因與NDM－1克雷伯氏菌印度分離株同源性也是100%，但在blaNDM－1結(jié)構(gòu)基因的下游和trpF之間有24bp的插入片段。這段24bp的插入片段至少在耐藥基因溯源上具有重要價(jià)值，還極有可能具有特殊的生物學(xué)意義，值得深入研究。

野生菌株及重組菌株對(duì)美洛培南（碳青霉烯類抗生素）最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果顯示，獲得了blaNDM－1基因的E．coli DH5α重組菌株對(duì)美洛培南的MIC升高了256倍，證明了blaNDM－1基因是碳青霉烯類抗生素耐藥性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）對(duì)美洛培南的 MIC值仍然比NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌低4倍，可能的原因是該株NDM－1鮑曼不動(dòng)桿菌還存在其他耐藥機(jī)制，能夠協(xié)同抵抗此類抗生素的作用。

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab）是不動(dòng)桿菌屬中最常見(jiàn)的一種革蘭陰性球桿菌，屬于條件致病菌，常常引起醫(yī)院相關(guān)感染［7］。從醫(yī)院環(huán)境分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，往往對(duì)多種抗生素耐藥，常被稱為“革蘭氏陰性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Gram－negative MRSA）”［8］。 因 此，這 些 獲 得 了NDM－1質(zhì)粒的鮑曼不動(dòng)桿菌，可使醫(yī)院發(fā)生相關(guān)感染的危害程度增加，治療更加困難。由于blaNDM－1基因在多種腸桿菌科細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)［9］，說(shuō)明此基因可以在不同細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，這樣就可能使得更多的細(xì)菌攜帶此基因。因此，攜帶blaNDM－1基因的細(xì)菌有可能給人類造成重大的健康威脅。

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