廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術(shù)的建立和優(yōu)化＊

宋增梅，黃慧聰，潘長(zhǎng)旺

蛋白質(zhì)組學(xué)是一門(mén)迅速發(fā)展的學(xué)科，在疾病或組織的蛋白表達(dá)和功能研究中，雙向凝膠電泳（2－DE）是強(qiáng)有力的研究工具［1］。雙向凝膠電泳由于其在展示全部蛋白質(zhì)表達(dá)改變并鑒定特異性蛋白方面的優(yōu)勢(shì)，已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究首選的分離技術(shù)［2］。

廣州管圓線蟲(chóng)病，又稱嗜酸粒細(xì)胞增多性腦膜炎或嗜酸粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎，是由廣州管圓線蟲(chóng)（Angiostrongyluscantonensis）寄生于人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)所致，是一種人獸共患病。但是，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于廣州管圓線蟲(chóng)蛋白組學(xué)的報(bào)導(dǎo)不多，亦無(wú)關(guān)于此線蟲(chóng)系統(tǒng)的雙向電泳的報(bào)道。為了建立具有高分辨率可重復(fù)的廣州管圓線蟲(chóng)雙向凝膠電泳技術(shù)，我們針對(duì)雙向電泳技術(shù)中的各種參數(shù)進(jìn)行初步探索和優(yōu)化，為廣州管圓線蟲(chóng)蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究和新功能蛋白的發(fā)現(xiàn)提供基礎(chǔ)的科學(xué)材料和參考方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)由本實(shí)驗(yàn)室分離、－80℃保存。

1.2 主要試劑及儀器 尿素（urea）、硫脲（thiourea）、3－［3－（膽酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸鹽（CHAPS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、固相膠條（IPG strip pH 3～10/pH 4～7，17cm），Bio－lyte pH 3～10，2－D clean up試劑盒等均購(gòu)于Bio－Rad公司；蛋白酶抑制劑混合液（Sigma），其它化學(xué)試劑均為分析純。

PROTEAN IEF CELL聚焦儀，PROTEAN II XL垂直板電泳儀，GS－800掃描成像系統(tǒng)，PDQuest凝膠圖像分析軟件（Bio－Rad公司），722s紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 50條廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)用0.01 mol/L PBS洗滌3次，收集于1.5mL Ep管內(nèi)；加入200μL裂解 液（7mol/L 尿 素、2mol/L 硫 脲、4%CHAPS、40 mmol/L Tris－Base、40mmol/L DTT、0.2%Bio－Lyte）和 1 μL蛋白酶抑制劑混合液；用研磨棒在冰上研磨使其充分溶解，于凍存管中室溫靜置1h；液氮中凍融3次；4℃，12 000 r/min離心30min，收集上清；2－D clean up試劑盒處理所得上清；100μL裂解液重懸沉淀，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 等電聚焦電泳（Isoelectronic Focusing） 參考文獻(xiàn)［3］方法，根據(jù)樣品情況適當(dāng)改進(jìn)。分別將200μg蛋白樣品與與水化上樣緩沖液（8mol/L 尿素、2%CHAPS、15mmol/L DTT、0.2%Bio－Lyte、0.001%溴酚藍(lán)）共300μL混合后均勻加入聚焦槽內(nèi)；選用pH 3～10和pH 4～7（17cm，線性）的IPG膠條，膠條膠面朝下，水化液浸濕整個(gè)膠條，上面覆蓋3mL礦物油，進(jìn)行第一向等電聚焦電泳，調(diào)整運(yùn)行參數(shù)如表1所示。

表1 等電聚焦參數(shù)Tab.1 The parameters of isoelectric focusing

1.3.3 第二向SDS電泳（SDS－PAGE） 聚焦后的IPG 膠條依次在平衡緩沖液 Ⅰ（6mol/L尿素、2%SDS、20% 甘油、50mmol/L Tris－HCl pH 8.8、1%DTT）和平衡緩沖液Ⅱ（前4種同上，2.5%IAA）中各平衡15min；平衡后移至12%SDS－PAGE凝膠上端，2mL熱的瓊脂糖溶液封頂。電泳參數(shù)設(shè)置為10mA/gel電泳15min后改為30mA/gel，進(jìn)行電泳。

1.3.4 銀染 電泳結(jié)束后2塊凝膠按照表2的程序進(jìn)行硝酸銀染色。

表2 凝膠銀染程序Tab.2 The procedures of silver staining

1.3.5 圖像的采集與處理 銀染的凝膠用GS－800Calibrated Densitometer圖像掃描儀透射掃描，PDQuest7.4.0軟件對(duì)2－DE凝膠采集圖像進(jìn)行詳細(xì)處理、分析。

2 結(jié) 果

2.1 樣品的蛋白質(zhì)含量 按照Bradford法，配制不同濃度BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入考馬斯亮藍(lán)G250工作液，波長(zhǎng)595nm測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.974 7，見(jiàn)圖1所示。經(jīng)計(jì)算廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)蛋白含量約為10.4mg/mL。

圖1 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of protein concentration

2.2 兩種膠條進(jìn)行2－DE的圖像比較 以pH3～10膠條進(jìn)行的2－DE，蛋白質(zhì)點(diǎn)分布較集中，各蛋白點(diǎn)間間距較小，分辨率較低（圖2A）；以pH4～7膠條進(jìn)行的2－DE，膠雖然分離蛋白范圍相對(duì)較小，但分辨率較高，蛋白點(diǎn)為719個(gè)，各蛋白點(diǎn)間距相對(duì)較大，且蛋白分布均勻，分子量大多分布在24.3～97.2kDa之間（圖2B）。

因此，在進(jìn)一步進(jìn)行廣州管圓線蟲(chóng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究過(guò)程中，選用固相膠條（IPG，pH4～7，17cm）進(jìn)行電泳。在相隔60d后運(yùn)用廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期雄蟲(chóng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳后，得到如圖3所示的電泳圖譜。如圖所示，蛋白點(diǎn)較多且清楚，沒(méi)有明顯條紋，背景干凈清晰，蛋白分布均勻，效果比較好。

圖2 A：固相膠條pH3～10；B：固相膠條pH4～7Fig.2 A：IPG strip of pH3～10；B：IPG strip of pH4～7

圖3 廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期雄蟲(chóng)雙向電泳銀染圖Fig.3 The silver stained map of two－dimensional electrophoresis on larvaeⅤof nake A.cantonensis

3 討 論

近年來(lái)，蛋白組學(xué)廣泛應(yīng)用在血液［4］、尿液［5］、唾液［6］等組織或疾病的診斷與預(yù)后，受到人們的關(guān)注。蛋白質(zhì)組具有的高通量、大規(guī)模、整體性蛋白質(zhì)水平的研究特點(diǎn)成為了解、探索及研究寄生蟲(chóng)學(xué)最有利的工具之一。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)可以研究提供寄生蟲(chóng)生活史不同階段的發(fā)育蛋白圖譜、細(xì)胞圖譜和蛋白質(zhì)功能，為寄生蟲(chóng)藥物治療和疫苗研究提供新靶點(diǎn)和候選物質(zhì)。雙向凝膠電泳（two－dimensional gel electrophoresis，2－DE）是目前常用的一種能夠連續(xù)在一塊膠上分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法，廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)方面［7］。而且各種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，蛋白質(zhì)組學(xué)研究獲得了廣泛和快速的發(fā)展，不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為許多系統(tǒng)疾病機(jī)理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑［8－10］。

廣州管圓線蟲(chóng)能夠侵入人體神經(jīng)系統(tǒng)致病，對(duì)人類造成極大危害。在此次實(shí)驗(yàn)中，我們采用與人類關(guān)系最密切的廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)作為研究對(duì)象，首先，在樣品的制備過(guò)程中盡可能解聚蛋白和擴(kuò)大其溶解度，提高分辨率，常用方法是化學(xué)法和機(jī)械裂解法相結(jié)合。我們采取加入裂解液進(jìn)行研磨、反復(fù)凍融的方法制備可溶性蛋白，同時(shí)注意溫度控制和避免使用對(duì)蛋白有影響的化學(xué)制劑；其次，在電泳的各個(gè)環(huán)節(jié)中，其影響因素較多，比如蛋白樣品的上樣量、還原劑的濃度、聚焦電壓的控制、染色方法等［11］。其中，膠條pH 的選擇非常重要，目前有許多pH范圍的膠條，首先選擇寬范圍的膠條如pH3～10，其分離的蛋白范圍較大，但寬范圍的膠條是否適合實(shí)驗(yàn)樣本，需根據(jù)具體情況采用不同范圍膠條電泳后進(jìn)行比較分析。窄范圍的膠條如pH4～7雖然分離蛋白的范圍相對(duì)較小，但各蛋白點(diǎn)間距較大，切膠容易，在相同的pH范圍內(nèi)可檢測(cè)到更多的蛋白點(diǎn)。因此，我們采用不同pH的膠條（分別為pH3～10和pH4～7）對(duì)制備的廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用pH3～10的膠條進(jìn)行雙向電泳，蛋白質(zhì)點(diǎn)分布較集中但各蛋白點(diǎn)間間距較??；而pH4～7的膠條進(jìn)行的雙向電泳分辨率較高，蛋白點(diǎn)為719個(gè)，且蛋白分布均一，其分離的各蛋白點(diǎn)間距相對(duì)較大，避免了高豐度掩蓋了低豐度蛋白點(diǎn)，在相同的pH范圍內(nèi)，檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)更多，靈敏度更高。因此，選擇pH4～7的IPG膠條分離廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)蛋白較為理想。高濃度還原劑DTT也能影響2－DE的結(jié)果，會(huì)造成等點(diǎn)聚焦不充分，蛋白質(zhì)不能有效分離［11］。此次實(shí)驗(yàn)選取水化液DTT濃度為15mmol/L，得到的分離效果相對(duì)較好，各蛋白點(diǎn)清晰可見(jiàn)。此外，若蛋白上樣量過(guò)大，各蛋白點(diǎn)顯得大、濃，相鄰點(diǎn)蛋白濃度過(guò)高而重疊，而且可能會(huì)出現(xiàn)水平條紋或拖尾現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中用200μg蛋白上樣量分離的蛋白點(diǎn)比較清晰。在染色方法中，銀染可檢出凝膠上0.1～0.5ng的蛋白質(zhì)，比普通考馬斯亮藍(lán)染色法靈敏度高50～100倍［11］。我們運(yùn)用銀染方法，檢測(cè)出719個(gè)蛋白點(diǎn)。第三，我們也考慮到二維電泳的重復(fù)性問(wèn)題，在控制上樣量、選擇合適pH值的IPG膠條、固定各項(xiàng)參數(shù)后，重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，該實(shí)驗(yàn)方法具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)篩選出pH4～7范圍內(nèi)廣州管圓線蟲(chóng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)分離較好，初步建立了廣州管圓線蟲(chóng)Ⅴ期幼蟲(chóng)蛋白質(zhì)組的雙向電泳凝膠圖譜，為進(jìn)一步進(jìn)行廣州管圓線蟲(chóng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究提供了實(shí)驗(yàn)參考。利用蛋白質(zhì)組學(xué)尋找差異表達(dá)的蛋白可能為由廣州管圓線蟲(chóng)引起的疾病的藥物研究提供靶標(biāo)和候選疫苗分子。但是，其詳細(xì)機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

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