袁帶秀，袁志忠，劉世彪*

(1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000;2.吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首416000)

絞股藍(lán)［Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makion］為葫蘆科(Cucurbitaceae)多年生草質(zhì)藤本植物，有“南方人參”和“第二人參”的美譽，別名小苦藥、公羅鍋底、五葉藤、遍地生根、甘茶蔓。多分布于亞熱帶地區(qū)，我國主要分布于陜西南部及長江以南各省區(qū)?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，絞股藍(lán)具有抗疲勞、降血脂、降血壓、促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝、增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤、防衰老、祛痰利尿等作用，臨床上用以治療氣管炎和傳染性肝炎等［1］。

同工酶是研究植物多樣性的有力工具，通過分析各種酶的同工酶電泳譜帶，可以識別出控制這些酶的基因位點和這些位點的多態(tài)性，并把遺傳變異數(shù)量化，可以較客觀地反映整個基因組的變異。由于酶譜帶的變化能直接反映出物種DNA分子水平上的變化，近20年來酶分析方法已廣泛應(yīng)用于植物種群的遺傳多樣性、遺傳分化及遺傳結(jié)構(gòu)等研究中［2－6］。目前人們對絞股藍(lán)同工酶譜的研究還較少［7－9］，尤其對不同物種絞股藍(lán)的同工酶的比較研究尚未見報道。本文以絞股藍(lán)、廣西絞股藍(lán)和五柱絞股藍(lán)為材料，對其過氧化物酶同工酶(POD)、酯酶同工酶(EST)和超氧物歧化酶同工酶(SOD)進(jìn)行比較研究，試圖通過同工酶分析來探討不同物種和同一物種不同器官中的同工酶酶譜特征及各種源之間的親緣關(guān)系，進(jìn)而為絞股藍(lán)的生理生化研究和絞股藍(lán)的綜合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料:五柱絞股藍(lán) G.pentagynum(編號為1號)、廣西絞股藍(lán)G.guangxiense(編號為2號)和絞股藍(lán) G.pentaphyllum(編號為3號)于2010年9月下旬，從吉首大學(xué)后山試驗園地分別隨機(jī)采集若干株，用蒸餾水洗凈，吸水紙吸干水分后，分別按其根、莖、葉不同器官依次取樣。

儀器:DYY－II－2C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYY－II－28A型垂直電泳槽、TGL－16G高速冷凍離心機(jī)、BINTA2020D凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 分別稱取五柱絞股藍(lán)(1號)、廣西絞股藍(lán)(2號)和絞股藍(lán)(3號)樣品(鮮品冷凍)1.0 g，加1 mol·L－1Tris－HCl(pH8.0)樣品提取液1 mL于冰浴研成勻漿，然后以1 mL提取液分幾次洗入離心管，在高速冷凍離心機(jī)上以8 000 r/min離心10 min，上清液加等體積40%的蔗糖溶液混勻，置冰箱內(nèi)冷藏，供點樣用。

1.2.2 試劑配制及凝膠制備 采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離膠:濃度為7.5%;濃縮膠:濃度為4%;電極緩沖溶液:pH 8.3的Tris－Gly系統(tǒng);分離膠灌制完成后置4℃冰箱中過夜。濃縮膠在電泳前灌制。

1.2.3 電泳 用微量進(jìn)樣器分別吸取20 μL樣品液緩緩注入樣品槽底部，在負(fù)極槽電極緩沖液中加入1滴溴酚藍(lán)指示劑示蹤，將電泳槽正負(fù)極與電泳儀正負(fù)極相連，電泳開始時控制電流為15 mA，待示蹤指示劑行至距瓊脂層約1 cm時關(guān)閉電源，停止電泳。整個過程約需2 h，為防止溫度過高，電泳過程在冰箱內(nèi)進(jìn)行。

1.2.4 染色 POD同工酶采用醋酸－聯(lián)苯胺染色法染色;EST同工酶采用乙酸－α－萘脂、乙酸－β－萘脂和固蘭RR鹽染色;SOD同工酶采用SOD活性法［2］。電泳結(jié)束后，染色、脫色、固定、拍照、作圖。

1.2.5 譜帶的相對遷移率和相似系數(shù)的計算 計算譜帶的相對遷移率(Rf)=酶帶遷移距離/指示劑遷移距離。相似系數(shù)(C)=2n/(n1+n2)×100%，式中n1為A酶譜的酶帶數(shù);n2為B酶譜的酶帶數(shù);n為A與B品種相同的酶帶數(shù)［3］。

2 結(jié)果與分析

2.1 POD 同工酶

從表1及圖1中可以看出，3個不同物種絞股藍(lán)根、莖、葉POD同工酶可分為三大酶區(qū):第Ⅰ酶區(qū)的相對遷移率為0.07～0.21;第Ⅱ酶區(qū)的相對遷移率為0.28～0.48;第Ⅲ酶區(qū)的相對遷移率為0.55～0.94。三大酶區(qū)中，根共有12條酶帶，莖共有12條酶帶，葉共有11條酶帶。3個物種的絞股藍(lán)根均含有酶帶②，莖均含有酶帶②、③，葉均含有酶帶①、⑧、⑩，且顏色最深，這可能是不同物種絞股藍(lán)的根、莖、葉在POD同工酶上的反應(yīng)，即酶帶②，酶帶②、③，酶帶①、⑧、⑩分別為不同物種絞股藍(lán)根、莖、葉在POD同工酶上的特征酶帶。

同一物種的絞股藍(lán)根、莖、葉組織中POD的表達(dá)具有一定的差異。五柱絞股藍(lán)(1號)的根有5條酶帶，莖有6條酶帶，葉有6條酶帶，其中根有2條強(qiáng)帶，莖有4條強(qiáng)帶，葉有5條強(qiáng)帶。廣西絞股藍(lán)(2號)的根有11條酶帶，莖有8條酶帶，葉有9條酶帶，其中根有4條強(qiáng)帶，莖有5條強(qiáng)帶，葉有7條強(qiáng)帶。絞股藍(lán)(3號)的根有8條酶帶，莖有6條酶帶，葉有9條酶帶，其中根有2條強(qiáng)帶，莖有3條強(qiáng)帶，葉有7條強(qiáng)帶。由此可見，POD同工酶活性在不同物種絞股藍(lán)的葉上表現(xiàn)最強(qiáng)，其次是莖，最后是根。

表1 絞股藍(lán)屬3種植物根、莖、葉POD同工酶譜帶的相對遷移率

圖1 絞股藍(lán)屬3種植物的根、莖、葉POD同工酶酶譜

2.2 EST 同工酶

從表2及圖2中可以看出，3個不同物種絞股藍(lán)的根、莖、葉EST同工酶表達(dá)位點較豐富，其酶區(qū)可分為三區(qū):第Ⅰ酶區(qū)的相對遷移率為0.03～0.12;第Ⅱ酶區(qū)的相對遷移率為0.17～0.4;第Ⅲ酶區(qū)的相對遷移率為0.5～0.94。三大酶區(qū)中，廣西絞股藍(lán)(2號)含有7條強(qiáng)帶，17條中強(qiáng)帶;絞股藍(lán)(3號)含有3條強(qiáng)帶，7條中強(qiáng)帶;五柱絞股藍(lán)(1號)含有2條強(qiáng)帶，9條中強(qiáng)帶。從酶帶強(qiáng)弱看，EST同工酶在廣西絞股藍(lán)(2號)的表達(dá)要強(qiáng)于其他兩個物種。

同一物種絞股藍(lán)的根、莖、葉EST表達(dá)也有一定的差異。從圖2中看出，五柱絞股藍(lán)(1號)的根有7條帶，其中中強(qiáng)帶4條，弱帶3條;莖有8條帶，其中強(qiáng)帶2條，中強(qiáng)帶1條，弱帶5條;葉有7條帶，其中中強(qiáng)帶4條，弱帶3條。廣西絞股藍(lán)(2號)的根有7條帶，其中強(qiáng)帶1條，中強(qiáng)帶4條，弱帶2條;莖有9條帶，其中強(qiáng)帶4條，中強(qiáng)帶5條;葉有10條帶，其中強(qiáng)帶2條，中強(qiáng)帶8條。絞股藍(lán)(3號)的根有7條帶，其中中強(qiáng)帶2條，弱帶5條;莖有5條帶，其中中強(qiáng)帶3條，弱帶2條;葉有5條帶，其中強(qiáng)帶3條，中強(qiáng)帶2條。綜合來看，不同物種絞股藍(lán)EST同工酶在莖、葉上的表達(dá)高于根。

2.3 SOD 同工酶

從表3和圖3中看出，3個物種的絞股藍(lán)及同一種絞股藍(lán)的不同器官的SOD表達(dá)都有一定差異。在SOD同工酶Rf為0.13位置上，五柱絞股藍(lán)(1號)的根、葉均表現(xiàn)為強(qiáng)帶，莖表現(xiàn)為中強(qiáng)帶;廣西絞股藍(lán)(2號)的根、莖、葉都表現(xiàn)為強(qiáng)帶;絞股藍(lán)(3號)的葉表現(xiàn)為強(qiáng)帶，莖表現(xiàn)為中強(qiáng)帶，根僅表現(xiàn)為弱帶。在Rf為0.23位置上，五柱絞股藍(lán)(1號)的葉表現(xiàn)為中強(qiáng)帶，根表現(xiàn)為弱帶，而莖沒有表現(xiàn)出酶帶;廣西絞股藍(lán)(2號)的根表現(xiàn)為中強(qiáng)帶，莖、葉表現(xiàn)為弱帶;絞股藍(lán)(3號)的根、莖、葉均表現(xiàn)為弱帶。在Rf為0.55位置上，五柱絞股藍(lán)(1號)的葉表現(xiàn)為強(qiáng)帶，而根、莖表現(xiàn)為弱帶;廣西絞股藍(lán)(2號)的根、莖、葉均表現(xiàn)為強(qiáng)帶;絞股藍(lán)(3號)的根、莖、葉均表現(xiàn)為中強(qiáng)帶。在Rf為0.83位置上，五柱絞股藍(lán)(1號)的莖、葉均表現(xiàn)為中強(qiáng)帶，而根表現(xiàn)為弱帶;廣西絞股藍(lán)(2號)的葉表現(xiàn)為強(qiáng)帶，莖表現(xiàn)為中強(qiáng)帶，而根表現(xiàn)為弱帶;絞股藍(lán)(3號)的莖、葉表現(xiàn)為強(qiáng)帶，根卻沒表現(xiàn)出酶帶。由上所述，可知酶帶①為3種絞股藍(lán)SOD同工酶在葉上的特征譜帶。從酶活性看，SOD同工酶在葉上表現(xiàn)最強(qiáng)，其次是莖，最后是根。3個物種絞股藍(lán)中，SOD同工酶在廣西絞股藍(lán)上表現(xiàn)最強(qiáng)。

表2 絞股藍(lán)屬3種植物根、莖、葉EST同工酶譜帶的相對遷移率

圖2 絞股藍(lán)屬3種植物的根、莖、葉EST同工酶酶譜

表3 絞股藍(lán)屬3種植物根、莖、葉SOD同工酶譜帶的相對遷移率

2.4 相似系數(shù)與親緣關(guān)系

同工酶的相似系數(shù)可以用于判定物種的親緣關(guān)系。本實驗以葉為例，從表4中看出，絞股藍(lán)不同物種間同工酶譜的相似系數(shù)為0.31～0.58，有較近的親緣關(guān)系;其中廣西絞股藍(lán)(2號)與絞股藍(lán)(3號)的相似系數(shù)最高，五柱絞股藍(lán)(1號)與絞股藍(lán)(3號)的相似系數(shù)最低，說明廣西絞股藍(lán)(2號)與絞股藍(lán)(3號)的親緣關(guān)系最近，五柱絞股藍(lán)(1號)與絞股藍(lán)(3號)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖3 絞股藍(lán)屬3種植物的根、莖、葉SOD同工酶酶譜

表4 絞股藍(lán)屬3種植物葉的同工酶相似系數(shù)

3 討論

植物的同工酶分析可以很好地了解植物的生理活動狀態(tài)。POD廣泛存在于高等植物的組織中，參與各種生理活動，具有多種分子形式的組織特異性，在植物不同生長發(fā)育時期其同工酶酶譜構(gòu)成及酶活性均存在差異，表現(xiàn)為多型現(xiàn)象。其變化與植物組織器官的分化、形成和生理狀態(tài)等密切相關(guān)，且酶譜變化先于形態(tài)分化［10－11］。EST是催化酯類化合物水解的酶系，它催化羧酸酯類的酯鍵的水解或合成，在植物不同的生長發(fā)育時期表現(xiàn)出器官特異性［12］。SOD廣泛存在于生物體內(nèi)的含金屬酶之一，是一種重要的氧自由基清除劑，它能催化超氧化物陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，產(chǎn)生分子氧和過氧化氫，具有多種生物學(xué)作用。

絞股藍(lán)屬植物具有17個種及變種［13］，前人僅對絞股藍(lán)的幾種同工酶進(jìn)行了初步研究，絞股藍(lán)幼苗的POD同工酶具有3條帶［7］，而絞股藍(lán)愈傷組織中的POD同工酶則有7～9條帶［8］，SOD同工酶譜有12條帶，分為3個酶區(qū)［9］。本實驗對絞股藍(lán)同工酶電泳數(shù)據(jù)的分析表明，絞股藍(lán)的POD同工酶具有12條帶，具有3個酶區(qū);SOD同工酶具有4條帶，也具有3個酶區(qū)。造成這種差異的原因是在生長發(fā)育過程中，植物器官或組織的生理特性和代謝過程會發(fā)生變化，同工酶的類型也會隨之變化。絞股藍(lán)不同器官的酶帶數(shù)和強(qiáng)弱差異的變化是較大的，其POD、EST、SOD同工酶酶帶在葉上表現(xiàn)最強(qiáng)，莖其次，根最弱。如EST同工酶帶數(shù)在五柱絞股藍(lán)的根、莖、葉上分別為7、8、7條，在廣西絞股藍(lán)的根、莖、葉上分別為7、9、10條，在絞股藍(lán)的根、莖、葉上分別為7、5、5條，這反映了不同種類植物不同器官的同工酶特異性表現(xiàn)是存在差異的。

酶譜可以反映不同植物物種間的相互聯(lián)系與區(qū)別，有助于判別物種間的親緣關(guān)系。酶譜的差異表現(xiàn)在酶帶顏色深淺不同和遷移率不同。本實驗證明了絞股藍(lán)不同物種之間既有共同酶帶，又有各自的特征酶帶，以廣西絞股藍(lán)酶帶總條數(shù)最多，五柱絞股藍(lán)酶帶總條數(shù)最少。根據(jù) Garva和 Tsunewaki(1977)等提出的“同工酶條帶越多的品系越進(jìn)化”的理論，同工酶譜條帶最少的五柱絞股藍(lán)較原始，條帶最多的廣西絞股藍(lán)分化程度較大，是3個物種中最為進(jìn)化的種質(zhì)。這種同工酶指標(biāo)在絞股藍(lán)不同物種之間的特異性，是與絞股藍(lán)屬不同物種形態(tài)學(xué)上的差異性一致的，因為絞股藍(lán)和廣西絞股藍(lán)屬于絞股藍(lán)亞屬，而五柱絞股藍(lán)屬于喙果藤亞屬［13］。因此，同工酶的酶譜分析完全可以作為絞股藍(lán)屬植物分類鑒定的重要依據(jù)。

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