齊 潔，萬(wàn)竹青，李默影，吳秋月，劉麗芳

(中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009)

楊梅葉為楊梅科楊梅屬植物楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)的干燥葉，楊梅廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南的浙江、江蘇、福建、廣東、廣西、江西、湖南等省。其果實(shí)是深受人們喜歡的水果之一。根據(jù)《中華本草》記載，楊梅葉味苦、微辛，性溫，功能為燥濕袪風(fēng)，止癢，主治皮膚濕疹，外用適量，煎水洗便可［1］。楊梅苷是楊梅葉中的有效成分之一，具有明顯的DPPH自由基清除能力［2］，對(duì)四氧嘧啶所致糖尿病小鼠有降血糖作用［3］，且具有明顯的降壓［4］、抑菌［5］等多種藥理活性，在食品抗氧化方面也具有很強(qiáng)的優(yōu)越性。因此，本文采用HPLC法對(duì)楊梅葉中的楊梅苷含量進(jìn)行測(cè)定，該方法快速，簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，為楊梅苷的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀;分析天平(Sartorius);KH－250DB超聲清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);RE－5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞容生化儀器廠);乙腈(色譜純，Merck公司);純凈水(娃哈哈純凈水);乙醇、磷酸(分析純)。

楊梅苷對(duì)照品(購(gòu)于上海同田生化技術(shù)有限公司，純度大于98%);楊梅葉(采自江西)，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)劉麗芳教授鑒定為楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Diamonsil C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)柱;流動(dòng)相:乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫程序(見(jiàn)表1);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):358 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μL。在該色譜條件下，楊梅苷理論塔板數(shù)為9750，楊梅苷與各峰的分離度R均大于1.5(見(jiàn)圖1、2)。

表1 梯度洗脫程序

圖1 楊梅苷對(duì)照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取楊梅苷對(duì)照品4.40 mg，置于5 mL量瓶中，以20%乙腈超聲溶解，定容，搖勻，配置成0.880 mg/mL，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取楊梅葉粗粉2.5 g，精密稱定，以50 mL 50%乙醇水浴回流提取1 h，過(guò)濾后，濾渣再同法提取2次，合并提取液。將提取液減壓回收乙醇后，用20%乙腈溶解定容至100 mL量瓶中，搖勻后，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取上述楊梅苷對(duì)照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于 1 mL 量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別配成 0.088，0.176，0.352，0.528，0.704，0.880 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液;分別精密吸取上述不同濃度對(duì)照品溶液20 μL注入色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，楊梅苷濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得過(guò)原點(diǎn)的回歸方程為A=36113C－401.56，r=0.9994，表明楊梅苷濃度在 0.088 ～0.880 mg/mL內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定楊梅苷峰面積，RSD=0.5%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批楊梅葉樣品，平行稱定6份，按照供試品溶液制備方法制備，每份精密吸取20 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算楊梅苷的含量，RSD=2.8%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別在 0，1，3，6，12，24 h 測(cè)定，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定楊梅苷峰面積，RSD=1.9%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已測(cè)定楊梅苷含量的楊梅葉適量，精密稱定9份，每3份為一組，分別加入樣品中所含楊梅苷量的80%，100%，120%對(duì)照品，按照供試品溶液的制備方法制備后，取續(xù)濾液20 μL進(jìn)行測(cè)定，所得平均回收率為102.4%，RSD=1.6%。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品測(cè)定

按照上述條件測(cè)定樣品，外標(biāo)法計(jì)算得楊梅葉中楊梅苷的平均含量為1.43%(n=3)。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 討論

實(shí)驗(yàn)中曾對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)正交試驗(yàn)法考察了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)楊梅苷含量的影響，并經(jīng)驗(yàn)證得到最優(yōu)提取條件為20倍50%乙醇提取1h，提取3次。

楊梅苷具有多種藥理作用，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。楊梅葉在我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)分布廣泛，為可再生資源，且其中楊梅苷含量高，本次實(shí)驗(yàn)為楊梅葉的合理開發(fā)利用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

［1］中華本草編委會(huì).中華本草［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:367－369.

［2］趙 麗，徐淑萍，張 蕾，等.楊梅素及類似物乙酰膽堿酯酶抑制和抗氧化活性研究［C］//2010年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國(guó)藥師周論文集，2010.

［3］張 立.楊梅苷對(duì)四氧嘧啶模型小鼠降血糖作用的初步研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(15):29－30.

［4］張秀橋，沈 偉，陳樹和，等.大葉蛇葡萄提取物對(duì)腎性高血壓大鼠降壓作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(24):2095.

［5］張紹勇，李 橋，陳安良.楊梅葉抑菌活性成分初步分離與鑒定［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(2):149－154.