許保磊，王 蓉

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京老年病醫(yī)療研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

谷氨酸是腦內(nèi)極為重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中超過(guò)40%以上的突觸為谷氨酸能突觸［1］。谷氨酸能神經(jīng)元廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，主要位于腦皮質(zhì)和腦邊緣系統(tǒng)區(qū)域。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)，但具有潛在的神經(jīng)毒性，可以導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。谷氨酸從谷氨酸能神經(jīng)末梢釋放，通過(guò)與不同的谷氨酸受體結(jié)合參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，同時(shí)必須從突觸間隙重新攝?。?］。胞外谷氨酸的過(guò)度蓄積和谷氨酸能受體的過(guò)度興奮增加了活性氧自由基和活性氮自由基生成，這些物質(zhì)可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激損害，促進(jìn)神經(jīng)元死亡［3］。因此，谷氨酸在胞外的濃度及其作用的時(shí)效需要精確的調(diào)節(jié)來(lái)滿(mǎn)足體內(nèi)的平衡，以阻止神經(jīng)元死亡。高親和力的鈉離子依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)對(duì)腦內(nèi)谷氨酸再攝取并保持適宜濃度起主導(dǎo)作用。谷氨酸濃度增加和許多神經(jīng)疾病有聯(lián)系，如癲癇、卒中、神經(jīng)退行性疾病等，因此，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能紊亂通常是此類(lèi)疾病的起因或者是導(dǎo)致腦損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)。本文對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，希望為開(kāi)發(fā)新型神經(jīng)保護(hù)藥物開(kāi)辟新的思路。

1 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的分布、作用及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)傳遞遞質(zhì)，通過(guò)谷氨酸受體介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)絕大多數(shù)突觸的快速興奮性突觸傳遞，參與腦內(nèi)諸多重要生理功能。正常狀態(tài)下，谷氨酸由神經(jīng)元突觸前膜釋放，激活神經(jīng)元突觸后膜上離子型谷氨酸受體。這個(gè)過(guò)程導(dǎo)致鈉離子和鈣離子內(nèi)流入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞膜去極化產(chǎn)生動(dòng)作電位，完成生理功能。

突觸間隙谷氨酸濃度及突觸后膜上離子型谷氨酸受體活性通過(guò)谷氨酸的釋放和清除緊密調(diào)節(jié)［4，5］。胞外谷氨酸的清除主要由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)負(fù)責(zé)完成。目前，已分離和克隆五種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體亞型［6］。最初在大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名的轉(zhuǎn)運(yùn)體有：GLAST，GLT-1和EAAC1，然后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并命名與三者對(duì)應(yīng)的人類(lèi)同源體為：興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(excitatory amino acid transporter 1，EAAT1)，興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2(EAAT2)和興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(EAAT3)。剩余兩個(gè)亞型，人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物共同命名為EAAT4和EAAT5。所有的轉(zhuǎn)運(yùn)體均以不同的結(jié)構(gòu)形式分布于各個(gè)腦組織結(jié)構(gòu)中。GLAST免疫染色和蛋白表達(dá)檢測(cè)提示其主要位于小腦，而在海馬和前腦等腦組織僅少量表達(dá)。GLT-1分布和GLAST正好相反，主要在前腦表達(dá)，在小腦的表達(dá)量很小。這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體是最重要的膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體，它們主要位于膠質(zhì)細(xì)胞膜或貝格曼膠質(zhì)細(xì)胞興奮性突觸上。EAAT3在全腦分布，但數(shù)量均很少。EAAT4和 EAAT5主要分布于小腦和視網(wǎng)膜［4，6，7］。EAAT是一種和細(xì)胞膜綁定的類(lèi)似于離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)泵。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體在維持胞外谷氨酸濃度上扮演著重要的角色，它們維持較低的谷氨酸的生理水平，這有利于促進(jìn)生物功能同時(shí)抑制興奮毒性。谷氨酸釋放到胞外后，轉(zhuǎn)運(yùn)體迅速?gòu)陌庠贁z取谷氨酸來(lái)保持其較低的濃度，從而適時(shí)中斷突觸傳遞［7］。谷氨酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)耗能過(guò)程，它需要克服巨大的濃度梯度。研究者將EAAT命名為：協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子——通常用來(lái)描述一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)同向和反向協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)離子來(lái)完成某種物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程通過(guò)協(xié)同綁定一個(gè)底物分子，即三個(gè)鈉離子和一個(gè)氫質(zhì)子到EAAT的外部構(gòu)象開(kāi)始，進(jìn)而觸發(fā)構(gòu)象級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致EAAT構(gòu)型轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)部構(gòu)象，釋放底物分子，鈉離子和質(zhì)子進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)。隨后，轉(zhuǎn)運(yùn)體借助反向轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子恢復(fù)外部構(gòu)象，重新可以在突觸間隙接受新的底物分子［8-10］。

谷氨酸的再攝取受到多個(gè)不同機(jī)制的調(diào)控［11］。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)受到環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、神經(jīng)因子、各種腦損傷反應(yīng)等調(diào)節(jié)［12］。比如，垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽 (pituitary adenylate cyclase-activating peptide，PACAP)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它可以增加膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GLT1［13］。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的激活可以通過(guò)磷酸化、巰基氧化、花生四烯酸等因素調(diào)控［11，12］。此外，改變轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞膜上的定位和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)活化也有關(guān)系［14］。盡管所有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞類(lèi)型都可以表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，但是星型膠質(zhì)細(xì)胞是谷氨酸再攝取的最主要細(xì)胞類(lèi)型［15］。星型膠質(zhì)細(xì)胞的鈉依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)體最初是從大鼠腦內(nèi)克隆而來(lái)，命名為GLAST和 GLT-1。該轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性通常也可以在多個(gè)水平調(diào)節(jié)，比如蛋白表達(dá)、細(xì)胞膜的通透性、蛋白綁定、磷酸化等［16］。

2 谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性在神經(jīng)退行性變化中的作用

神經(jīng)退行性變化是由于神經(jīng)元結(jié)構(gòu)或功能的持續(xù)性丟失所致。神經(jīng)元的死亡，在某些情況下是由于觸發(fā)了某個(gè)過(guò)程導(dǎo)致的細(xì)胞壞死或細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、III型細(xì)胞死亡。激發(fā)細(xì)胞死亡的過(guò)程包括蛋白降解上的缺陷、氧化應(yīng)激物質(zhì)產(chǎn)生、鈣失調(diào)、線(xiàn)粒體功能紊亂以及興奮性毒性等，這些途徑的交叉作用已經(jīng)有所報(bào)道［17］。因此，神經(jīng)元死亡更多的是一個(gè)連續(xù)性的復(fù)雜過(guò)程，某一種機(jī)制不能完整解釋神經(jīng)元的死亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能是通過(guò)半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶 (caspases)-8或 -10這一途徑刺激細(xì)胞表面死亡受體(death receptor DR)信號(hào)。另外，細(xì)胞凋亡還可能通過(guò)線(xiàn)粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器發(fā)出的信號(hào)觸發(fā)內(nèi)在 caspase-9相關(guān)途徑。自噬是一種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，能夠通過(guò)降解細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等成分實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。長(zhǎng)期激活自噬可導(dǎo)致細(xì)胞死亡?，F(xiàn)有研究表明，自噬實(shí)際上是一種保護(hù)性過(guò)程或從保護(hù)性轉(zhuǎn)向凋亡的變化過(guò)程，是泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)的補(bǔ)償機(jī)制［18］。因此，自噬可能在由聚集的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)所引起的神經(jīng)退行性病變中起到作用。一些神經(jīng)退行性疾病，源于某種程度的錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，包括阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷頓氏舞蹈癥和肌萎縮側(cè)索硬化癥等［19］。這些錯(cuò)誤折疊的蛋白可以觸發(fā)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性變化。

在創(chuàng)傷、缺血性疾病以及神經(jīng)退行性疾病的病理過(guò)程中都涉及到谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性。對(duì)谷氨酸受體的過(guò)度刺激能夠?qū)е麓罅坑泻Φ慕Y(jié)果，比如鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、增加NO產(chǎn)生、蛋白酶激活、增加細(xì)胞毒素轉(zhuǎn)錄因子和自由基等［20］。谷氨酸受體過(guò)度刺激還可導(dǎo)致突觸后神經(jīng)元的胞外鈣超載及多種離子失衡，加重興奮性毒性［21］。這些因素從不同機(jī)制誘發(fā)神經(jīng)元進(jìn)入上述不同特點(diǎn)的死亡過(guò)程，加重神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化。因此，谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性對(duì)于神經(jīng)退行性疾病具有重要的影響。

3 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT2的調(diào)節(jié)機(jī)制

EAAT2是人腦內(nèi)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體中最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中主要為 GLT-1，EAAT2主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)［22］。目前研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)退行性疾病病理機(jī)制中，EAAT2的功能紊亂或者降低其表達(dá)能夠顯著影響谷氨酸的再攝取，導(dǎo)致谷氨酸在胞外積聚及神經(jīng)元死亡，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病比如ALS、亨廷頓氏舞蹈癥、癲癇、卒中、外傷等可見(jiàn)報(bào)道［23］。EAAT2在全腦和脊髓都有表達(dá)，膠質(zhì)細(xì)胞上的EAAT2負(fù)責(zé)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)90%的谷氨酸再攝取［24］。然而，在少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上的EAAT2的作用目前尚不清楚。由于EAAT2在預(yù)防谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性及維持正常腦功能中的顯著作用，研究人員開(kāi)展了大量調(diào)控人EAAT-2表達(dá)的機(jī)制研究。研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類(lèi)動(dòng)物GLT-1mRNA和蛋白表達(dá)水平能夠被腫瘤壞死因子a(tumor necrosis factor-α，TNF-α)下調(diào)，而被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(transforming grow th factor，TGF-a)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和環(huán)磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)上調(diào)［25］。為了進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平研究EAAT-2表達(dá)的調(diào)控，Su等2003年明確了人EAAT-2啟動(dòng)子位點(diǎn)位于啟動(dòng)碼上游283bp節(jié)點(diǎn)［26］。前期研究證實(shí)，EAAT-2在培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，但是在與神經(jīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞中可以誘導(dǎo)其表達(dá)［27］。這個(gè)結(jié)果得到了進(jìn)一步的模擬重現(xiàn)。用神經(jīng)細(xì)胞基質(zhì)或者用cAMP、EGF、PACAP處理膠質(zhì)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)EAAT2的表達(dá)［26］。這些干預(yù)手段可以調(diào)控 EAAT2mRNA水平和轉(zhuǎn)錄速率［28］。通過(guò)藥理學(xué)和基因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，上述結(jié)果主要是通過(guò)PI3K和 NF-kB信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)［29］。此外，NF-kB還可以直接與 EAAT2啟動(dòng)子相結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。NF-kB是一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄活化因子，它不僅僅能激活 EAAT2mRNA的表達(dá)，而且在某些因素作用下還可以抑制EAAT2mRNA的表達(dá)［28］。

4 藥物對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 EAAT2調(diào)節(jié)影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)

目前，有15種FDA批準(zhǔn)的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素在老鼠的脊髓切片實(shí)驗(yàn)中證實(shí)能夠提高EAAT2的活性和其蛋白水平。體外實(shí)驗(yàn)中，熒光素標(biāo)記人EAAT2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染到初級(jí)胎兒膠質(zhì)細(xì)胞(primary human fetal astrocytes，PHFA)，給予多種化合物處理，可以觀(guān)察到頭孢曲松鈉(ceftriaxone，CEF)、阿莫西林等能夠提高EAAT2活性和蛋白水平，而谷氨酸和甘氨酸是無(wú)效的［30］。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 PHFA模型可以作為篩選選擇性上調(diào)EAAT2啟動(dòng)子活性化合物的適宜模型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，頭孢曲松鈉能夠提高大鼠腦內(nèi) GLT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)［30］。CEF在低氧低糖(oxygen glucose deprivation，OGD)模擬缺血環(huán)境下，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制源于CEF能夠增強(qiáng)EAAT2蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性［31］。CEF還能夠降低谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑(threo-hydroxyaspartate，THA)誘導(dǎo)的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失。此外，CEF可以延緩神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型G37A SOD1大鼠的肌肉力量及體重下降［30］。NF-kB信號(hào)通路對(duì)于頭孢曲松鈉(CEF)導(dǎo)致的EAAT2表達(dá)上調(diào)具有主要作用。NF-kB綁定于 272位點(diǎn)是 CEF介導(dǎo)的EAAT2蛋白誘導(dǎo)的關(guān)鍵步驟［32］。

研究者進(jìn)一步篩選了能夠潛在調(diào)節(jié)谷氨酸水平的藥物。有研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞中EAAT2表達(dá)具有潛在調(diào)節(jié)作用［33］。在培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞介質(zhì)中加入EGF和胰島素，提高了絲/蘇氨酸激酶(serine threonine kinase Akt1)和 mTOR的磷酸化水平及EAAT2蛋白表達(dá)。給予Akt1抑制劑處理后，能夠下調(diào)m TOR的磷酸化水平及EAAT2蛋白表達(dá)。然而，給予 m TOR抑制劑干預(yù)，可以降低EAAT2表達(dá)，但并不影響 Akt1磷酸化水平。所以，作用于雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路藥物能夠上調(diào)EAAT2表達(dá)。Wu等研究了乙醇作用于膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，平衡 型 核 苷轉(zhuǎn) 運(yùn) 體 1(equilibrative nucleoside transporter，ENT1)和 EAAT2之間的作用關(guān)系［34］。ENT1是已知調(diào)節(jié)乙醇在腦內(nèi)影響的重要因素之一。ENT1特定抑制劑和siRNA技術(shù)共同干預(yù)能夠?qū)е履z質(zhì)細(xì)胞EAAT2表達(dá)和谷氨酸攝取下降。予以100mM乙醇治療后提高了EAAT2的表達(dá)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性。乙醇導(dǎo)致的EAAT2mRNA水平增加能夠被ENT1特定siRNA處理抑制，所以，ENT1在乙醇調(diào)節(jié)EAAT2表達(dá)的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。此外，有學(xué)者報(bào)道，cAMP信號(hào)通路在乙醇對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)EAAT2表達(dá)中發(fā)揮作用［35］。因此，雷帕霉素和乙醇等化合物通過(guò)調(diào)節(jié)EAAT2表達(dá)在神經(jīng)變性病領(lǐng)域具有潛在的治療機(jī)會(huì)。

綜上所述，EAAT2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和保持胞外谷氨酸低水平在神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用［36］，因此使用EAAT2啟動(dòng)子的篩選模式來(lái)篩選驗(yàn)證在動(dòng)物體內(nèi)合理安全的調(diào)節(jié)谷氨酸水平的分子，進(jìn)而應(yīng)用到人體，是一個(gè)全新的切入點(diǎn)，由此來(lái)開(kāi)發(fā)新的通過(guò)控制突觸間隙谷氨酸水平的神經(jīng)保護(hù)新藥。此外，通過(guò)化學(xué)建模，有可能開(kāi)發(fā)出新的CEF的衍生物，增強(qiáng)其藥理和生物活性，使其更容易通過(guò)血腦屏障，提高對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療作用。

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