程肖蕊，周文霞，張永祥

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所中藥和神經(jīng)免疫藥理研究室，北京 100850)

網(wǎng)絡藥理學(Network pharmacology)是從系統(tǒng)生物學和生物網(wǎng)絡平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程、從改善或恢復生物網(wǎng)絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發(fā)現(xiàn)。因此，它是在高通量組學數(shù)據(jù)分析、計算機模擬計算及網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫檢索的基礎上，進行生物網(wǎng)絡的構建及分析，進而進行藥物作用機制的研究及創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)［1－2］。目前，網(wǎng)絡藥理學一方面受限于現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫的完整性和準確性［3］，另一方面很難對基于網(wǎng)絡所建立的預測模型(如靶點組合、通路組合、子網(wǎng)組合、藥物組合或多靶點藥物等)進行驗證或鑒定，因此，網(wǎng)絡藥理學的發(fā)展依賴于實驗新技術新方法的發(fā)展和突破。

網(wǎng)絡藥理學的研究思路通常可分為2類:一是根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫和公開發(fā)表的已有數(shù)據(jù)，建立特定藥物作用機制網(wǎng)絡預測模型，預測藥物作用靶點/機制，從生物網(wǎng)絡平衡的角度解析藥物作用的藥理學機制。如有研究者在闡釋抗糖尿病中藥復方糖敏靈作用機制的基礎上，采用虛擬篩選和網(wǎng)絡預測的手段對Rheidin A、Rheidin C、番瀉苷C(sennoside C)、原花青素C1(procyanidin C1)和二氫哈爾滿(Dihydrobaicalin)這幾種從未報導過具有抗2型糖尿病作用的成分進行預測就采用了上述思路［4］;同樣對麻黃湯(herba ephedrae decoction，HED)新藥理作用進行的預測［5］也采用了上述思路。二是利用各種組學技術以及高內(nèi)涵/高通量技術，觀察藥物對模型(分子、細胞、組織或/和動物)的作用或模型對藥物的作用，針對所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，采用生物信息學的手段分析和構建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡，建立預測模型，進而解析所研究藥物的網(wǎng)絡藥理學機制。當然，這兩個思路也可并行發(fā)展、綜合分析，如有些對丹酚酸B治療心血管疾病的作用進行系統(tǒng)研究即采用了此思路［6］。網(wǎng)絡藥理學研究中與實驗相關的環(huán)節(jié)有兩個:一是基于實驗結果構建網(wǎng)絡所需基本數(shù)據(jù)的獲取，另一個是對所建立的網(wǎng)絡預測模型進行實驗驗證，這兩個環(huán)節(jié)涉及的技術均應具有可高通量、定量、快速、靈敏、簡便、可靠地獲取大量數(shù)據(jù)的特點，這樣才能滿足網(wǎng)絡藥理學建立在海量數(shù)據(jù)基礎上的研究要求。綜合近年來生命科學研究領域技術方法的進展，目前網(wǎng)絡藥理學研究在實驗研究水平所涉及的相關技術除了組學(基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組和糖組等)技術外，主要包括3個方面:高通量/高內(nèi)涵技術、雙高通量基因表達檢測技術和分子相互作用技術。

1 高通量/高內(nèi)涵技術

高通量(high though-put assay，HTS)/高內(nèi)涵技術(high content assay，HCS)是指在保持細胞、組織或整體動物結構和功能完整性的前提下，一次性檢測成百上千個處理且同時檢測被篩樣品對活細胞、組織或整體動物多個表型的作用，如形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導各個環(huán)節(jié)等。其特點是可在單一實驗中獲取大量相關信息，可應用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)和后續(xù)的自動數(shù)字圖像分析、處理、儲存技術進行高度整合，具有均質(zhì)、多維表型檢測、實時動態(tài)監(jiān)測和可視化的特點。因此，這種具有多維表型檢測的HTS/HCS技術［7－9］適合網(wǎng)絡藥理學研究需要海量、準確數(shù)據(jù)的要求。

1.1 基于細胞的高通量/高內(nèi)涵技術

高通量/高內(nèi)涵技術在細胞模型上是應用最為成熟的，它通過自動顯微攝影和圖像自動分析，全景式準確、快速、目標導向性的定量檢測細胞包括復雜的解剖學結構和生化特性在內(nèi)的各種表型。如其應用于神經(jīng)科學可定量樹突的各個指標、蛋白聚集、轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位、神經(jīng)遞質(zhì)受體內(nèi)化、神經(jīng)元和突觸數(shù)量、細胞遷移和分化及凋亡等。這種在細胞模型上的高通量/高內(nèi)涵技術結合組學技術所產(chǎn)生的結果，可為網(wǎng)絡藥理學研究中網(wǎng)絡的構建提供無偏、準確的基本數(shù)據(jù)，并對網(wǎng)絡結構中基序(motif)和功能模塊(module)的確定提供信息。

在基于細胞模型的高通量/高內(nèi)涵技術中應用最為廣泛的是報告基因技術。它使連接有靶基因的報告基因能在細胞中表達，并能通過報告基因的表達變化反映靶基因表達的激活或抑制。目前主要使用的報告基因為外源性熒光蛋白或熒光素酶，通過熒光或發(fā)光的方法檢測報告基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物變化，可靈敏地反映細胞內(nèi)某種特定生化或信號轉(zhuǎn)導通路的改變等。例如，對防治阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的重要靶點γ-分泌酶活性研究即可采用該方法［10］。γ-分泌酶裂解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)胞內(nèi)段產(chǎn)生 β － 淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)、Notch和其他細胞底物，研究中可將膜結合的熒光探針綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)(即報告基因)連接在γ-分泌酶的底物APP或APP的C99片段上，使APP-GFP/APP-C99-GFP在細胞中表達，若γ-分泌酶有活性時就切割帶有標簽的底物，熒光從質(zhì)膜轉(zhuǎn)向胞質(zhì)，那么利用高內(nèi)涵儀器檢測質(zhì)膜與胞質(zhì)熒光強度的比值即可檢測細胞γ-分泌酶的活性，也可將細胞通透洗去胞質(zhì)中熒光后，使用流式細胞儀檢測質(zhì)膜熒光的剩余量而評價γ-分泌酶活性，進而可用于篩選和評價 γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑［11］。

此外，目前不依賴于報告基因技術，而基于免疫熒光技術的高通量、全景式檢測細胞表型的高內(nèi)涵技術也得到了長足的發(fā)展和應用。如在培養(yǎng)的大鼠原代皮層細胞，可同時使用微管蛋白(tubulin)一抗配合FITC標記的二抗對神經(jīng)元進行綠色標記、GFAP一抗配合TRITC標記的二抗對膠質(zhì)細胞進行紅色標記、以及Hoechst對細胞核進行藍色標記，采用高內(nèi)涵技術分別對標記神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、細胞核的熒光強度進行檢測，觀察Aβ42對神經(jīng)突外向生長的影響。結果表明，Aβ42300 nmol·L－1～30 μmol·L－1的可顯著減少神經(jīng)突外向生長，但卻不減少神經(jīng)元的數(shù)目。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體拮抗劑美金剛和煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)選擇性激動劑PNU-282987可減弱Aβ42縮減神經(jīng)突外向生長的作用。α7 nAChR拮抗劑甲基牛扁亭堿(methyllycaconitine)可顯著防止Aβ42導致的突起生長減少。這種基于細胞能同時全景式(或整板全孔)檢測多個表型的高內(nèi)涵分析技術在評價神經(jīng)保護藥物方面具有明顯優(yōu)勢［12］。比如，有研究者通過構建過表達四重復Tau蛋白(4 repeat tau，4R0N)的H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系，以總Tau和12E8Tau(pS262和pS356)為表型指標，可進行高內(nèi)涵siRNA篩選，也可高內(nèi)涵評價激酶對Tau蛋白磷酸化的作用。利用該體系以磷酸化Tau抗體12E8配合Cy5標記的二抗對磷酸化tau進行標記、以Tau抗體配合FITC標記的二抗對總Tau進行標記、使用Hoechst對核進行標記，使用高內(nèi)涵技術檢測紅色、綠色和藍色熒光強度，對572個激酶對Tau蛋白磷酸化的作用進行了評價，結果發(fā)現(xiàn)了3個激酶即EIF2AK2，DYRK1A和AKAP13具有磷酸化12E8Tau的作用［13］。另外，又如使用PC12細胞和原代培養(yǎng)的小腦顆粒細胞進行神經(jīng)突外向生長和藥物對神經(jīng)突生長作用的高內(nèi)涵評價［14］;使用自動化細胞培養(yǎng)和高內(nèi)涵圖像技術研究高通量shRNA對神經(jīng)細胞模型SH-SY5Y細胞系的作用［15］。在神經(jīng)元，使用高內(nèi)涵圖像分析可監(jiān)測嚙齒類皮層混合原代培養(yǎng)神經(jīng)元神經(jīng)突觸生長以及藥物對其影響的情況［16］，并可使用高內(nèi)涵檢測和神經(jīng)突圖像定量軟件分析Aβ對小鼠皮層神經(jīng)元神經(jīng)突生長的影響，篩選抑制神經(jīng)突丟失的藥物［17］。

1.2 基于組織的高通量/高內(nèi)涵技術

在組織水平建立高通量/高內(nèi)涵技術，可觀察到復雜的多細胞相互作用及其表型，則更接近生物體本身的情形，為網(wǎng)絡藥理學研究中定位或預測特定表型的功能子網(wǎng)或模塊(module)的基本數(shù)據(jù)獲取提供了手段。

1.2.1 數(shù)字切片掃描技術

數(shù)字切片掃描技術是一種現(xiàn)代數(shù)字系統(tǒng)與傳統(tǒng)光學顯微鏡有機結合的技術，它將傳統(tǒng)的玻璃病理切片通過全自動顯微鏡掃描采集得到高分辨數(shù)字圖像，再應用計算機對得到的圖像自動進行高精度、多視野、無縫隙拼接和處理，以獲得優(yōu)質(zhì)的整片及其整片可視化數(shù)據(jù)。數(shù)字切片系統(tǒng)主要由自動掃描顯微鏡系統(tǒng)、圖像采集(數(shù)碼攝像頭)系統(tǒng)、自動圖像掃描采集控制軟件、數(shù)字切片瀏覽器、圖像處理軟件和計算機、自動上片系統(tǒng)等組成。這種高通量/高內(nèi)涵的獲取和定量分析整片(無偏)組織病理圖像技術，不但對于疾病的基本病理生理學和疾病進程的研究具有重要應用價值，而且可為網(wǎng)絡藥理學的研究快速提供準確數(shù)據(jù)。目前主要有3種掃描技術，即線性掃描(line scanning)、逐行掃描(progressive scanning)和光矩陣掃描(optical matrix scanning)。

線性掃描技術的核心是時間延遲積分(time delay integration，TDI)線性掃描，在40×模式分辨率可達到0.23μm/像素，且具備紅、綠、藍三基色通道，可以實現(xiàn)掃描樣本的原色恢復。使用該技術的目前主要有Aperio ScanScope?CS、Aperio ScanScope?XT、Hamamatsu C9600 NanoZoomerTM等系統(tǒng)。如使用NanoZoomer系統(tǒng)可一次將210張組織切片裝載在切片盒中，數(shù)字切片掃描系統(tǒng)可自動上載切片，以20×或40×掃描，整片定量分析石蠟包埋和冰凍切片以及涂片特定指標(如Aβ斑塊)的免疫組化(明場)或免疫熒光(多色熒光)結果［18－20］。獲得的數(shù)字切片可用于本地和遠程分析/診斷。采用上述系統(tǒng)在8 h內(nèi)可獲取32張染色的AD病人腦切片圖片并分析出可靠結果，22 h內(nèi)可獲取100張APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織切片并分析出可靠結果，能夠準確區(qū)分AD和非AD患者［21］。使用Aperio ScanScope系統(tǒng)不但能夠定量評估病毒導致的淋巴細胞浸潤、小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)退化［22］，而且通過對45例AD病人的腦切片研究表明，腦萎縮的速率不是由灰質(zhì)中的不溶性Aβ量來決定的，腦萎縮/腦室擴大的速率與總Aβ、可見Aβ增加速率無關，而與年齡、Braak神經(jīng)原纖維纏結階段、認知變化緊密相關［23］。

逐行掃描是指每一幀圖像均是由電子束自左到右、并沿垂直方向自上到下以均勻速度依次一行緊接一行連續(xù)掃描而成。15 mm×15 mm的切片可掃描獲得800幀圖片，圖片分辨率為1280×1024像素。使用該技術的目前主要有Nikon Coolscope，Olympus dotSlide，Zeiss MIRAX Scan，Zeiss MIRAX Midi和Zeiss MIRAX Desk等系統(tǒng)。研究表明，使用逐行掃描技術的Zeiss MiraxScan系統(tǒng)的準確率、敏感性、分辨率與傳統(tǒng)切片相同，但其卻具有整片性、存貯方便、可遠程分析和診斷的優(yōu)點［24］。使用Zeiss MiraxScan系統(tǒng)建立了包括普通絨毛猴(Callithrix jacchus)、恒河猴(rhesus monkey)、日本猴(Japanese monkey)在內(nèi)的猴脊索的數(shù)字切片庫［25］。同樣使用逐行掃描技術的Nikon Coolscope系統(tǒng)已被用于對肺癌的遠程診斷［268］以及對丙戊酸導致前列腺癌細胞系核結構變化的研究［27］。

光矩陣掃描技術使用微型透鏡陣列和傳感器陣列進行區(qū)域掃描，其分辨率為0.5μm。使用該技術的目前主要有DMetrix DX-40系統(tǒng)，該系統(tǒng)已被應用于乳腺癌和乳腺增生病理切片的遠程診斷、教學和學術交流中［28］。

1.2.2 高通量神經(jīng)電生理記錄技術

包括有多個微電極(刺激電極和記錄電極)陣列技術的神經(jīng)電生理記錄系統(tǒng)可以無創(chuàng)無標記的在組織上進行多通道神經(jīng)電生理信號采集和記錄，其高通量特性適于藥物處理后急性分離腦片、藥物處理培養(yǎng)腦片的誘發(fā)性活動(場興奮性突觸后電位)、自發(fā)性活動(尖峰波形信號)、突觸可塑性(長時程增強和長時程抑制)等的研究，也適于網(wǎng)絡藥理學研究中基于網(wǎng)絡的預測模型的驗證研究。目前，該類技術報道較多的有兩種，分別為MED64平面微電極陣列系統(tǒng)(Alpha Med Science，Japan)和多電極陣列 (multielectrode arrays，MEA)系統(tǒng)(MultiChannelSystems，Germany)。

MED64平面微電極陣列技術采用鉑黑微電極陣列，可同時獲取64個位點的電生理信號，而且所有電極既可用作記錄電極，也可用作刺激電極。使用該技術在急性分離的海馬片上研究表明，NMDA受體的NR2亞基可能是皮層網(wǎng)絡產(chǎn)生的關鍵，在癲癇發(fā)作過程中可導致募集更大范圍的震蕩［29］。將大鼠海馬腦片培養(yǎng)在該系統(tǒng)的多電極微陣列上進行電生理信號的采集和記錄，發(fā)現(xiàn)重復的長時程抑制誘發(fā)刺激能夠促使培養(yǎng)的海馬腦片突觸前和突觸后結構的分離，突觸的消除伴隨著海馬神經(jīng)元功能可塑性的變化［30］。

多電極陣列系統(tǒng)至少含有直徑為30μm用硝酸纖維素包被的60根氮化鈦電極，以8×8的陣列進行排列?？赏瑫r使用4個放大器，采集卡能夠同時處理多達128通道的信號。使用該技術在海馬腦片上可檢測神經(jīng)突退化的兩個階段即神經(jīng)突快速腫脹階段(比對照高的電阻并緊跟一個較慢的崩潰相)和片段化階段(比對照低的電阻)以監(jiān)測神經(jīng)軸突退化情況，評價Tau蛋白磷酸化對神經(jīng)元的損害［31］。

1.3 基于模式生物的高通量/高內(nèi)涵技術

基于模式生物(如果蠅、線蟲、爪蟾和斑馬魚等)的高通量/高內(nèi)涵技術，不但可在整體生物體生理環(huán)境下研究生長、發(fā)育和疾病的機制，篩選和評價藥物，而且可從網(wǎng)絡的構建、網(wǎng)絡結構拓撲學和功能拓撲學的分析到網(wǎng)絡預測模型的建立等各個層面上揭示藥物的網(wǎng)絡藥理學作用原理。目前研究較多的有線蟲(Caenorhabditis elegans)和斑馬魚。

1.3.1 線蟲

線蟲是細胞定數(shù)動物，神經(jīng)系統(tǒng)僅有302個細胞，約占整個動物體細胞總數(shù)的三分之一。胚胎平均大小為50μm，成蟲為1 mm長、30μm寬，蟲體透明。線蟲神經(jīng)系統(tǒng)含有高等動物腦的大多數(shù)分子成分，身體其余系統(tǒng)亦含有類似人類的多個分子成分，可用于網(wǎng)絡藥理學的研究。如利用線蟲建立機械刺激學習模型、溫度趨向性模型、有害刺激學習模型和NaCl物質(zhì)學習模型，采用高內(nèi)涵技術檢測藥物對其行為學的作用，觀察神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)極性的變化等。

Albrecht等［32］建立了一種可允許線蟲自主爬行的微流控制系統(tǒng)，可對線蟲的行為進行高內(nèi)涵分析。該微流裝置2 cm×2 cm，布滿直徑為200μm的圓柱形突起，兩突起中心距離300μm，液體在突起間流動。上下游有障礙以限制線蟲的活動區(qū)域，具有刺激輸入口和輸出口以及蟲體入口。有時間脈沖、空間分布和線性濃度梯度3種刺激模式。這些刺激均通過水相傳遞，從而消除了氣-液轉(zhuǎn)換導致的控制差異。每個刺激模式都有3個參數(shù):轉(zhuǎn)向動力學、進入氣味帶的方向以及速度(可通過氣味調(diào)節(jié))。該裝置可同時測試4種刺激和4個獨立的蟲群。利用該裝置通過定量分析幾十種行為參數(shù)，已定義了野生型線蟲和感知突變型線蟲預期的和非預期的反應。這種基于線蟲的高通量/高內(nèi)涵技術的建立，可進行行為學、光遺傳學、鈣成像分析或進行高通量藥物篩選等，并可應用于神經(jīng)環(huán)路的功能及其遺傳和分子機制的研究。

使用脂滴特異性染料Bodipy 493/503對脂肪染色并采用流式細胞術結合顯微鏡觀察的方法對線蟲的代謝進行研究，結果表明，Bodipy對固定的和活的線蟲染色均能看見主要脂肪存貯、天然脂滴形態(tài)，并可定量分析每個蟲體所含的脂肪量。飲食限制、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)和種系突變可表現(xiàn)出各自特異的脂肪/蟲體積比率。這種方法能夠敏感、準確和高通量的在單個線蟲水平評估大群體線蟲的肥胖情況［33］。

基因譜的高內(nèi)涵篩選往往限于單個細胞，Green等［34］建立了一種基于多細胞生物復雜組織結構的分析方法。他們通過對線蟲性腺組織結構成像，獲得了554個線蟲必需基因，可分為94個表型。為了尋求網(wǎng)絡構建的評價標準，將這554個基因分成102個表型組，用于預測不同細胞生理途徑的基因的功能。進而基于基因間連接重要性的分級，建立了利用高內(nèi)涵數(shù)據(jù)譜構建基因網(wǎng)絡的穩(wěn)定的計算方法。這種在復雜組織采用多參數(shù)譜構建的功能圖譜與來源于真核單細胞的基因相互作用譜具有相似的分辨率。這種基于整體動物或復雜組織表型譜的高分辨率基因網(wǎng)絡構建方法為網(wǎng)絡藥理學研究提供了有力的實驗研究工具。

1.3.2 斑馬魚(Danio rerio，zebrafish)

作為脊椎動物，斑馬魚與人類的基因同源性很高。斑馬魚的胚胎和幼魚身體透明，眼部相對較大，胚胎平均大小為1.2 mm，成蟲為6 cm，便于形態(tài)學檢測和發(fā)育過程觀察。利用活體成像技術可實時觀測相關蛋白的表達、特定表型的(神經(jīng))細胞分布、神經(jīng)生長或突觸發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復中神經(jīng)元損傷后存活和修復及髓鞘再生等現(xiàn)象。另外，也可使用斑馬魚制造多種疾病模型以用于藥物篩選和評價，如針對人的 APP，PSEN1，PSEN2，NCSTN，PSENEN和 BACE1，斑馬魚有與之對應的基因 APPa/b，psen1，psen2，ncstn，psenen和 zgc:77409。有人使用反義嗎啡林(morpholino，MO)對斑馬魚的Pen-2(presenilin enhancer)基因的表達進行敲減探討了Pen-2對神經(jīng)存活的影響及其可能的機制［35］，為AD發(fā)病機制及防治藥物研究提供了新的模型和實驗體系。此外，也有人使用 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導斑馬魚帕金森氏病模型［36］，使用五甲烯四氮唑(pentylenetetrazol，PTZ)誘導斑馬魚癲癇模型［37］等。這些研究提示斑馬魚在神經(jīng)退行性疾病的研究中具有較為廣泛的應用范圍和應用前景。

基于報告基因，使用活的斑馬魚，可建立整體動物模型的高通量高內(nèi)涵原位檢測技術，從而實現(xiàn)活體藥物的篩選和評價。如基于報告基因青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)、綠色熒光蛋白(GFP)、黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)、非穩(wěn)定單體黃色熒光蛋白(destabilized monomeric yellow fluorescent protein，PhiYFP-dest1)、單體紅色熒光蛋白(monomeric red fluorescent protein，tagRFP)、mCherry、2'，7'-二氯二氫-二乙酸鹽(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein-diacetate，DCFH-DA)，使用熒光讀板機，每天可至少檢測50 000個測試(unit)，其 Z'因子≥0.5，可使用斑馬魚胚胎、卵、幼蟲定量分析細胞數(shù)量(如胰腺β細胞、視桿光感受器等)、細胞信號轉(zhuǎn)導(如轉(zhuǎn)Notch信號轉(zhuǎn)導受體基因斑馬魚等)、細胞代謝(如活性氧積聚等)等［38］。Peravali等［39］使用斑馬魚基于標準寬域掃描顯微鏡建立了一種具有細胞分辨率的自動智能化高內(nèi)涵技術，使用該技術建立了轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胚胎腦3-D數(shù)據(jù)庫。而且根據(jù)背部準確定位，可獲得高分辨率內(nèi)部器官和細胞結構圖像。使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚，采用定量的、高內(nèi)涵圖像分析技術在多孔板在體檢測藥物對纖維生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)信號轉(zhuǎn)導的作用，結果表明包含F(xiàn)DA批準的藥物在內(nèi)的1040個化合物有兩個分子即8－羥基喹啉硫酸酯(8-hydroxyquinoline sulfate)和巰氧吡啶鋅(pyrithione zinc)具有增強腦中特定區(qū)域FGF信號轉(zhuǎn)導的作用［40］。

2 雙高通量基因表達檢測技術

在網(wǎng)絡藥理學相關研究中，不論是基于實驗的網(wǎng)絡構建所需基本數(shù)據(jù)的獲取，還是對所構建的網(wǎng)絡模型進行實驗驗證，均需要使用具有檢測樣品高通量、檢測目標基因高通量的雙高通量、快捷、準確、靈敏的技術。顯然，基于核酸雜交的基因芯片技術(基因組芯片、cDNA芯片、Oligo芯片、miRNA芯片等)因其每次只能檢測一對樣品而限制了其在網(wǎng)絡藥理學中的應用。

2002年Fakhari［41］提出的 PCR芯片技術，是將與研究對象有關的基因的引物固定于固相載體上，形成陣列，通過簡單的、經(jīng)過優(yōu)化的定量PCR體系和熒光定量PCR儀，實現(xiàn)待檢樣品中基因的擴增，進而用于定量檢測待檢樣品中基因的表達情況。與傳統(tǒng)基于核酸雜交的基因芯片相比，PCR芯片具有操作流程簡單、定量結果無需后期驗證、特異性強、靈敏度高以及重復性好等優(yōu)點。目前報道較多的有OpenArray?System(Applied Biosystems，USA)和 BioMark? System(Fluidigm，USA)。

OpenArray?System PCR芯片可同時檢測96個樣品的96個PCR反應，或每個樣品可同時檢測9216種基因。在一項基于中國人的病例-對照研究中，使用OpenArray? System檢測了580例男性不育癥和580例對照的6個抗氧化基因GPX1，CAT，PON1，NQO1，SOD2/MnSOD和SOD3的11個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)并進行基因分型，結果表明 PON1 Arg192Glu(rs662)和 SOD2 Val16Ala(rs4880)變異基因型與高風險男性不育癥相關，攜帶有這兩個變異基因型的個體其不育癥發(fā)生風險高出兩倍，而且這兩個基因間存在互作。攜帶有PON1 Arg192Glu(rs662)或SOD2 Val16Ala(rs4880)的個體其精子DNA片段化和8－OHdG的水平也顯著增高。表明抗氧化基因的遺傳變異可導致精子DNA損傷與男性不育［42］。介導二噁英和多環(huán)芳氫等環(huán)境化合物毒性的配體激活轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)的 SNP 中，rs2158041 的 G突變也與中國人男性不育有關［43］。同樣在強直性脊柱炎研究中發(fā)現(xiàn)，基因STAT3，TNFRSF1A和2p15的多態(tài)性與中國漢族人的強直性脊柱炎有關［44］。另外，該系統(tǒng)也已用于O157和非O157型腸出血性大腸桿菌中與毒性、血清分型和噬菌體作用區(qū)有關的基因表達檢測［45］。

BioMark?System集成流體通道(integrated fluidic circuits，IFC)PCR芯片目前最多可同時進行36 960個PCR反應。使用該系統(tǒng)的48×48動態(tài)陣列檢測128例Ⅱ～Ⅲ期直腸癌患者血液中胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)、表皮生長因子(epidermal growth factor receptor)、切除修復交叉互補基因1(excision repair cross－complementing 1)、X射線修復交叉互補組1(X-ray repair cross-complementing group 1，XRCCG1)、著色性干皮病D組(xeroderma pigmentosum group D)基因的多態(tài)性，結果表明TS的基因多態(tài)性和XRCCG1 Arg399Gln多態(tài)性可輔助指示同步放化療有較好預后的Ⅱ～Ⅲ期直腸癌患者［46］。同樣使用該系統(tǒng)的48×48動態(tài)陣列檢測了抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗體片段 C 部分(antibody fragment C portion，F(xiàn)cγ)多態(tài)性和KRAS基因突變與104例用抗-EGFR抗體治療的難治性轉(zhuǎn)移性結直腸癌(refractory metastatic colorectal cancer，mCRC)臨床療效的相關性，結果表明，F(xiàn)ccRIIa和FccRIIIa多態(tài)性并不是mCRC病人臨床療效有用的分子標記。因此，迄今為止，癌癥分類的研究和治療歐洲組織(European Organization for Research and Treatment of Cancer Classification，EORTC)、皮膚毒性和KRAS基因狀態(tài)是唯一可靠的生物標志物，以確定患者受益于抗EGFR治療［47］。另外，使用該系統(tǒng)對33例司他夫定(stavudine，d4T)處理的病人TS、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)、還原葉酸載體1(reduced folate carrier 1，RFC1;SLC19A1)和細胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)的基因多態(tài)性，結果表明TS基因的多態(tài)性與胞內(nèi)司他夫定三磷酸腺苷(d4T-TP)水平和艾滋病毒/高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療相關的脂肪代謝障礙綜合征(HIV/highly active antiretroviral therapy-associated lypodystrophy syndrome，HALS)病程高度相關［48］。

3 分子相互作用技術

從網(wǎng)絡藥理學角度揭示藥物作用原理或?qū)λ鶚嫿ǖ乃幬镒饔镁W(wǎng)絡或預測模型進行驗證的本質(zhì)在于揭示藥物分子與機體生物大分子之間的相互作用關系，因此需要觀察藥物與單個及多個生物分子之間的相互作用，同時也需要觀察多個生物分子之間的相互作用。目前研究分子相互作用的方法有很多，但從檢測通量和分子量范圍來講，主要有兩種，一種是基于表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)的檢測技術，另一種是基于生物膜層干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)的檢測技術，這兩種技術均具有無標記、高通量、高精度且實時檢測的特點，能夠提供分子相互作用結合速率常數(shù)(Ka)、解離速率常數(shù)(Kd)和親和常數(shù)(KD)。

SPR技術的基本原理是當入射光以臨界角射入，在金屬膜表面內(nèi)發(fā)生全反射，產(chǎn)生消失波，一定條件下消失波激發(fā)金屬表面自由電子使之成為等離子體，而當表面等離子體與消失波的頻率波數(shù)相等時，此時將發(fā)生共振現(xiàn)象并出現(xiàn)共振峰。當金屬表面樣品的折射率發(fā)生變化，共振峰的位置會發(fā)生相應的變化，由此可以檢測待測物與配體發(fā)生的結合情況。金屬與介質(zhì)表面的存在是形成表面等離子體共振的基本條件之一，而檢測生物分子間相互作用的特異性主要取決于偶聯(lián)在傳感器芯片表面的配體的特性。SPR生物傳感器對溫度和流體的湍流情況比較敏感，適于檢測分子量較大(＞1000 Da)的分子。如在AD發(fā)病機制研究中，使用SPR技術研究Aβ聚集和寡聚體形成機制時，檢測到Aβ42與微管聚合促進蛋白(tubulin polymerization promoting protein，TPPP/p25)的結合KD為85 nmol·L－1，可通過抑制生理性相關的TPPP/p25源微管聚集而導致異常蛋白的聚集［49］。Neuroligin-1(NL-1)是興奮性突觸的一個特異突觸后細胞粘附蛋白，NL-1與Aβ的結合KD在nmol·L－1水平，而NL-2(抑制性突觸的一個特異突觸后細胞粘附蛋白)則與Aβ結合非常弱，研究表明NL-1而不是NL-2與Aβ相互作用增加Aβ寡聚體的形成［50］。在AD藥物發(fā)現(xiàn)和藥物機制研究中，基于SPR技術，將從腦脂質(zhì)提取物分離的脂質(zhì)膜固定在芯片上，并通過識別β-分泌酶(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE1)的C-末端的抗體捕獲BACE1，然后進行與BACE1相互作用分子的研究。這種技術能夠更好的在接近生理條件下研究與BACE1相互作用的分子［51］，從而篩選BACE1抑制劑。使用SPR技術，檢測人血白蛋白(Albutein)與sAβ42的結合KD的結果表明，血白蛋白可以與Aβ結合，可能對AD具有治療作用［52］。γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑舒林酸硫化物(sulindac sulfide)及其衍生物可直接與Aβ序列結合，而且γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑和APP跨膜序列結合的減弱與Aβ42活性的降低、Aβ序列結合的強度高度相關，表明γ-分泌酶抑制劑降低Aβ42水平是通過調(diào)節(jié)APP跨膜序列相互作用來達到的［53］。

BLI的原理是用生物分子相容層覆蓋光纖制成的生物傳感器底端，用來固定相互作用分子中的一個，形成生物膜層。當分子相互作用發(fā)生時，生物層厚度增加，反射光干涉光譜曲線整體向波長增加方向移動。分子結合或解離時，都會導致干涉曲線的漂移。能直接檢測血清、細胞裂解液、細菌、細胞培養(yǎng)液、組織勻漿等樣品［54］。使用BLI技術在食蟹猴血漿中定量檢測人源化抗體治療療效，結果表明，BLI技術與酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技術具有同等的選擇性、基質(zhì)效應、精度和準確度，但靶點干擾方面BLI則優(yōu)于ELISA。ELISA 的動態(tài)檢測范圍在0.1 ～10 mg·L－1，而BLI為0.4 ～50 mg·L－1。而且對于低濃度樣品，BLI的重復性要高于ELISA［55］。BLI技術可以96和384孔的通量進行生物分子相互作用的檢測，與SPR相比，更適于小分子特征的研究和片段篩選，通過以BCL-2，JNK1和eIF4E為靶點對6500個化合物的篩選，結果表明BLI技術不但可確證生物化學方法檢測的結果，而且能夠發(fā)現(xiàn)生化方法難以揭示的有著非典型結合譜的化合物和新候選化合物［54］。

4 展望

網(wǎng)絡藥理學從生物網(wǎng)絡的角度系統(tǒng)地揭示藥物和機體相互作用的規(guī)律和原理，發(fā)現(xiàn)基于網(wǎng)絡生物學的疾病發(fā)病機制及藥物作用靶點，創(chuàng)制基于生物網(wǎng)絡的候選新藥。網(wǎng)絡藥理學實驗研究的技術與方法要求具有高通量、可定量、快速、靈敏度和準確性高的特點。除了組學技術外，目前能夠在該領域發(fā)揮主要作用的有高通量/高內(nèi)涵技術、雙高通量基因表達檢測技術和分子相互作用技術。但這些技術尚存在明顯缺陷，僅能解決網(wǎng)絡藥理學實驗研究中遇到的部分問題，如多數(shù)僅能實現(xiàn)分子或細胞水平的研究、可同時觀察或檢測的分子或生物效應有限、難以全面揭示生物機體內(nèi)分子間及其與藥物之間的復雜相互作用關系等等，因此，網(wǎng)絡藥理學實驗研究相關新技術新方法的誕生仍是亟待解決的難題。

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