河南省科學(xué)院生物研究所 劉德海 解復(fù)紅 賈 彬

河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心 陳國參 權(quán)淑靜 馬煥

脂肪酶又稱甘油酯水解酶，能夠催化天然底物油脂的分解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶，其天然底物是生物產(chǎn)生的天然油脂，是最早被研究的酶類之一，作用于異相系統(tǒng)，即在油水界面上水解脂肪酸甘油酯，而只有當(dāng)?shù)孜镆晕⒘?、小聚合分散狀態(tài)或成乳化顆粒時(shí)，脂肪酶對底物水解才有顯著的催化作用。脂肪酶被廣泛應(yīng)用于食品、生物、飼料等領(lǐng)域，在許多方面已顯示出不可估量的開發(fā)潛力。

1 脂肪酶的來源

脂肪酶普遍存在于動(dòng)物、植物組織和多種微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽等，當(dāng)油料作物種子發(fā)芽時(shí)，脂肪酶能與其他酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)，為種子生根發(fā)芽提供所必需的養(yǎng)料和能量；動(dòng)物胰臟和脂肪組織內(nèi)含大量脂肪酶，動(dòng)物消化道內(nèi)脂肪酶主要包括十二指腸前脂肪酶和十二指腸內(nèi)的胰脂肪酶。十二指腸前脂肪酶指來源作用于動(dòng)物的胃和口腔，用于補(bǔ)充胰脂肪酶對脂肪消化的不足；胰脂肪酶是由胰腺合成分泌的一種中性脂肪酶，其經(jīng)胰管流入十二指腸內(nèi)對脂肪起到消化分解的作用。而微生物脂肪酶種類最多，含量最為豐富，廣泛存在于細(xì)菌、霉菌和酵母中。

2 脂肪酶的性質(zhì)

由于脂肪酶產(chǎn)生菌種類眾多，不同微生物生產(chǎn)的脂肪酶結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等差異較大。脂肪酶基本組成為氨基酸，其催化活性決定于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)催化脂肪水解的多肽鏈，一般情況下折疊為N-末端和C-末端兩個(gè)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域，N-末端有結(jié)合脂肪酸的疏水通道，活性部位由組氨酸、絲氨酸與天冬氨基酸組成。脂肪酶分子質(zhì)量的大小因其來源不同而存在很大差異，不同來源脂肪酶的氨基酸組成數(shù)目為270～641，其分子質(zhì)量為29～100 kD；脂肪酶的性質(zhì)研究主要包括最適作用溫度與pH，脂肪酶最適作用溫度因其來源不同而差異很大，按最適作用pH可分為酸性、中性和堿性脂肪酶；最適反應(yīng)溫度一般在30～60℃，最適作用pH為4～10，不同來源脂肪酶的最適反應(yīng)溫度和作用pH差異也較大。來自于細(xì)菌的脂肪酶最適pH在中性或堿性范圍內(nèi)；來自于真菌的脂肪酶最適pH為4～10，最適反應(yīng)溫度較低。脂肪酶在底物濃度下處于溶解狀態(tài)，不表現(xiàn)酶活性或作用極其緩慢；只有當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥匠銎錁O限溶解度達(dá)到過飽和狀態(tài)時(shí)，才被激活表現(xiàn)出明顯的活性，這種現(xiàn)象稱為“界面活化現(xiàn)象”。

3 脂肪酶的生產(chǎn)

脂肪酶的生產(chǎn)方法有三種，即化學(xué)合成法（通過分析酶的氨基酸組成順序，然后用化學(xué)方法合成）、提取法（從動(dòng)植物器官或組織中提?。?、生物發(fā)酵法（利用微生物發(fā)酵獲得）?；瘜W(xué)合成法和提取法因試驗(yàn)技術(shù)等客觀條件而受到限制，微生物脂肪酶種類多，微生物發(fā)酵法成為脂肪酶主要生產(chǎn)方法，由于微生物資源豐富，并且種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動(dòng)植物更廣的作用pH和作用溫度范圍，且微生物來源的脂肪酶一般均是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，生產(chǎn)不受自然環(huán)境的影響，可通過人工控制來大量生產(chǎn)目的酶，此外，其生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，是一種經(jīng)濟(jì)而實(shí)用的方法，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。脂肪酶在微生物中具有廣泛的分布，已知大約有2%的微生物產(chǎn)脂肪酶，其產(chǎn)生菌包括細(xì)菌28個(gè)屬、放線菌4個(gè)屬、酵母菌10個(gè)屬、其他真菌23個(gè)屬，至少65個(gè)屬的微生物產(chǎn)脂肪酶。近年來，微生物脂肪酶的研究主要集中在高產(chǎn)菌株的選育、常規(guī)誘變育種、基因工程菌的構(gòu)建、發(fā)酵工藝優(yōu)化、酶的分離純化及工業(yè)化生產(chǎn)；提高脂肪酶酶活性的方法有誘變育種、構(gòu)建基因工程菌及優(yōu)化發(fā)酵工藝，利用分子生物學(xué)篩選脂肪酶高產(chǎn)菌株、通過基因工程克隆脂肪酶基因而大幅度提高脂肪酶產(chǎn)量成為主要手段。賈彬等（2010）克隆了洋蔥伯克霍爾德菌，實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母中快速穩(wěn)定的表達(dá)。脂肪酶產(chǎn)酶菌株的篩選主要利用培養(yǎng)平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離初篩，其主要方法有以下三種：（1）Rhodamine B平板篩選法。脂肪在脂肪酶的水解作用下，產(chǎn)生甘油和脂肪酸，脂肪酸和Rhodamine B的陽離子發(fā)生作用，生成黃色的熒光物質(zhì)，紫外燈下觀察，產(chǎn)脂肪酶的菌株周圍會(huì)產(chǎn)生熒光圈，依據(jù)熒光圈的大小進(jìn)行菌株的篩選；（2）溴甲酚紫平板篩選法。溴甲酚紫作為一種顯色劑，其pH為5.2～6.8，在堿性條件下顯紫色，酸性條件下顯黃色，脂肪在脂肪酶的作用下產(chǎn)生的脂肪酸會(huì)使培養(yǎng)基pH降低，產(chǎn)脂肪酶菌株的周圍會(huì)出現(xiàn)黃色的透明圈，根據(jù)透明圈的有無和大小來篩選產(chǎn)脂肪酶的菌株，透明圈越大說明產(chǎn)脂肪酶的能力越強(qiáng)；（3）瓊脂塊培養(yǎng)法。將分離的培養(yǎng)基用滅菌的打孔器制作成許多單個(gè)的直徑約6 cm的小瓊脂塊，排放在干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，將挑選的菌株接種在小瓊脂塊上培養(yǎng)，讓其充分生長，然后依次再將長滿菌落的小瓊脂塊放在酶活測定板上，28℃培養(yǎng)1～3 d，觀察各菌落周圍油脂水解圈的大小，在給定的時(shí)間內(nèi)，脂肪酶活力的大小與其催化水解生成脂肪酸的量成正比，將水解圈大的菌株純化后保藏在斜面培養(yǎng)基上。工業(yè)化生產(chǎn)的脂肪酶主要是微生物脂肪酶，包括細(xì)菌脂肪酶和真菌脂肪酶，細(xì)菌脂肪酶大多是胞外酶易于進(jìn)行液體深層發(fā)酵，發(fā)酵易于控制，不易污染雜菌，生產(chǎn)效率高，其主要生產(chǎn)菌有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等；真菌脂肪酶具有溫度及酸堿穩(wěn)定性強(qiáng)、發(fā)酵設(shè)備簡單、提取成本低等優(yōu)點(diǎn)，其主要生產(chǎn)菌有曲霉屬、假絲酵母等。首先運(yùn)用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)脂肪酶是丹麥Novo公司，Novo將柔毛腐質(zhì)霉堿性脂肪酶基因克隆出工程菌株米曲霉應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)，脂肪酶產(chǎn)量提高約1000倍（汪小鋒等，2008）。但有關(guān)飼料專用酸性脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)少有報(bào)道。

4 脂肪酶的檢測

脂肪酶的測定方法很多，根據(jù)原理不同主要有正乙烷抽提法、酸堿滴定法、分光光度法（銅皂顯色法、對硝基苯酯法）。中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法QB/T 1803-93》中規(guī)定了脂肪酶的檢測方法，酶活力定義為：1 g固體酶粉，于40℃，pH 7.5條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1 μmol的脂肪酸，即為1個(gè)脂肪酶國際單位，以U/g表示，其原理是：脂肪酶在一定條件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二脂、甘油單酯和甘油，所釋放的脂肪酸，可用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行中和滴定，用pH計(jì)或酚酞指示液指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)反應(yīng)消耗的堿量，計(jì)算其酶活力。飼料用酸性脂肪酶酶活性的檢測報(bào)道較少，這與飼用脂肪酶研究應(yīng)用較晚還處于起步階段有關(guān)，飼料用脂肪酶必須對胃腸道的酸性條件有一定的耐受性，并且在酶作用位點(diǎn)的pH范圍內(nèi)具有較高的活性，穩(wěn)定性好；檢測脂肪酶活性時(shí)反應(yīng)溫度、酸堿性要盡量接近畜禽體內(nèi)溫度及pH，這樣才能真實(shí)反應(yīng)出脂肪酶在畜禽腸道內(nèi)的作用情況。隨著飼用脂肪酶應(yīng)用日益廣泛，酶活力檢測顯得極為重要，尋找合適的測定方法是關(guān)鍵。

5 脂肪酶在飼料中的應(yīng)用

脂肪參與動(dòng)物機(jī)體的組成，是動(dòng)物必需的營養(yǎng)物質(zhì)，是畜禽體內(nèi)主要能量物質(zhì)，是機(jī)體最大的能量儲備庫，當(dāng)機(jī)體需要能量時(shí)，體內(nèi)脂肪在脂肪酶的作用下被分解，參與能量代謝，保證其健康生長，并可滿足畜禽特殊生長階段對高能量的需求。張照喜和馬玉勝（1997）試驗(yàn)表明，夏季在肉仔雞日糧中添加適量動(dòng)物脂肪可以有效緩解熱應(yīng)激，提高仔雞的采食量，改善飼料利用率和經(jīng)濟(jì)效益。蔡澤華和郭建同（2000）研究發(fā)現(xiàn)，在30日齡肉雞日糧中添加3%棕櫚油可明顯提高其日增重和飼料利用率。另外，在動(dòng)物飼料中添加脂肪可以改善飼料外觀油性，減少飼料加工過程中的粉塵污染，同時(shí)可增加動(dòng)物的食欲及其對脂溶性物質(zhì)的吸收。張鎮(zhèn)福等（2001）試驗(yàn)證明，油脂可以促進(jìn)脂溶性維生素和葉黃素的吸收利用。動(dòng)物飼料中的脂類必須經(jīng)脂肪酶分解成脂肪酸、甘油二脂、甘油單酯后，才能被畜禽機(jī)體消化、吸收和利用，在動(dòng)物體內(nèi)，各類脂肪酶控制著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程。目前商品化生產(chǎn)的脂肪酶產(chǎn)品，其pH穩(wěn)定性多在中性或堿性范圍內(nèi)，對酸的耐受性較差，而添加于飼料中的脂肪酶必須要經(jīng)過胃腸道的酸性環(huán)境才能達(dá)到內(nèi)源酶的水解作用位點(diǎn)，并能夠在作用位點(diǎn)的pH范圍內(nèi)具有較高的活性，因此，絕大多數(shù)脂肪酶不適用于飼料。Polin等（1980）在含4%動(dòng)物油的白來航公雞玉米基礎(chǔ)日糧中添加0.1%的胰脂肪酶，結(jié)果表明，添加胰脂肪酶能夠提高脂肪的吸收，但效果不顯著，原因可能是在腸道酸性條件下，不耐酸的胰脂肪酶容易失活，其到達(dá)主要作用位點(diǎn)（十二指腸）時(shí)活力較低。王琰等（2011）對飼料用耐酸性脂肪酶進(jìn)行研究，初步建立了具有當(dāng)?shù)靥厣奈⑸镏久妇N庫，酸性脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選模型，并選育出適用于飼料用的酸性脂肪酶菌株FL002。大量研究表明，微生物脂肪酶對動(dòng)物體內(nèi)源消化酶的分泌有一定的促進(jìn)作用，并有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。Tan等（2000）研究表明，在含全脂米糠、高油玉米、血粉等的飼料中添加脂肪酶，可提高飼料表觀消化率5%～11%，提高豬、禽增重速度4%～10%，提高飼料利用率2%～7%，并能減少糞便排泄量。何前等（2010）在黃羽肉雞飼料添加脂肪酶，能顯著提高飼料中粗脂肪的表觀利用率。但由于脂肪酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的多樣性，酶的不穩(wěn)定性，底物的不溶性和純化困難，使其研究進(jìn)展相對較慢。單胃動(dòng)物能夠分泌脂肪酶，但幼齡動(dòng)物內(nèi)源性脂肪酶的分泌量明顯不足。張振斌和蔣宗勇（1999）對14日齡仔豬斷奶后脂肪酶活性變化的研究表明，斷奶后胰脂肪酶活性不斷下降。Freeman（1976）研究報(bào)道，肉雞出殼時(shí)對動(dòng)物脂肪的利用率很差，隨日齡的增加活性逐漸增加。在飼料中添加外源脂肪酶能夠補(bǔ)充動(dòng)物特殊生理階段內(nèi)源脂肪酶的不足，提高脂肪的消化，微生物脂肪酶可提高斷奶仔豬等幼齡動(dòng)物的生產(chǎn)性能、緩解應(yīng)激、促進(jìn)動(dòng)物生長。王海燕等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，在幼禽、幼畜日糧中添加外源性淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，能夠補(bǔ)充動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源酶的不足，并能減輕斷奶仔豬的斷奶應(yīng)激，提高生產(chǎn)性能。時(shí)本利等 （2010）在斷奶仔豬常規(guī)豆粕-玉米型日糧中添加微生物脂肪酶，結(jié)果表明，添加脂肪酶可顯著提高仔豬日增重，降低料重比及腹瀉率。

6 小結(jié)

綜上可見，微生物脂肪酶在飼料中具有廣闊的應(yīng)用前景。許多國家規(guī)定了禁止在飼料中添加使用某些抗生素作為促生長劑，迫使飼料生產(chǎn)企業(yè)尋找替代品，加酶成為首選，隨著酶和底物以及腸道環(huán)境之間作用機(jī)理研究的不斷深入，酶技術(shù)的應(yīng)用前景也變得越來越寬廣，推動(dòng)了飼用酶的發(fā)展。

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