武漢工業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院

動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 竇茂鑫 趙迪 丁斌鷹 侯永清 吳濤＊

微生態(tài)飼用添加劑具有良好的生物學(xué)活性，能調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道微生物菌群的平衡，促進(jìn)動(dòng)物消化吸收、生長(zhǎng)發(fā)育，提高飼料轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)性能，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，以及具有改善飼養(yǎng)環(huán)境和減少環(huán)境污染的獨(dú)特作用（Gomze等，2007；王旭明等，2002）。芽孢乳酸菌因其同時(shí)具有乳酸菌和芽孢桿菌的優(yōu)點(diǎn)而成為為理想的益生菌之一 （相菲和徐厚春，2009）。本試驗(yàn)對(duì)飼用芽孢乳酸菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為微生態(tài)飼料添加劑的研發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)益生菌：芽孢乳酸菌，由武漢泛華生物技術(shù)有限公司提供；試驗(yàn)致病菌：大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸出物3 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，葡萄糖 15 g，瓊脂 15 g，調(diào)整pH 7.2，定容至1000 mL。普通液體培養(yǎng)基：普通瓊脂培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.1.3 主要試劑 PBS緩沖液，用于菌液的稀釋。

1.1.4 主要器材 電子天平 （沈陽(yáng)龍騰電子有限公司），酸度計(jì) （成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司），UV-1200 spectrophoto meter（美譜達(dá)儀器公司），立式超低溫保溫箱（海爾公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢乳酸菌的復(fù)蘇 將-20℃保存的菌株按1%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165 r/min條件下培養(yǎng)10～12 h，待渾濁后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將復(fù)蘇后菌液按5%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165 r/min條件下培養(yǎng)，以普通液體培養(yǎng)基作校正，測(cè)定不同時(shí)間段培養(yǎng)液的OD600值，前24 h每1 h一測(cè)，后36 h每2 h一測(cè)。

1.2.3 產(chǎn)酸能力測(cè)定 將復(fù)蘇后菌液按5%的接種量接種于普通液體培養(yǎng)基中，在37℃和165r/min條件下培養(yǎng)，測(cè)定不同時(shí)間段培養(yǎng)液的pH（郭志杰等，2010）。

1.2.4 高溫耐受性試驗(yàn) 將復(fù)蘇后菌液按1%的接種量接種于PBS緩沖液中，分別置于60、70、80、90℃的水浴鍋中處理10 min，分別于處理前和處理后進(jìn)行平板涂布，計(jì)算存活率 （范俊娟，2009）。

1.2.5 耐酸性試驗(yàn) 用鹽酸調(diào)節(jié)PBS緩沖液的pH 分別為 2.0、2.5、3.0、4.0，121 ℃高壓滅菌后備用。將復(fù)蘇菌液按1%的接種量接種于上述pH梯度稀釋液中，37℃作用3 h，渦旋混勻，涂布平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以0 h計(jì)數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率（劉文華等，2008）。

1.2.6 耐膽鹽試驗(yàn) 用PBS緩沖液配制濃度分別為0.2%、0.5%、0.8%、1.0%的豬膽鹽溶液，高壓滅菌后備用。按1%的接種量將復(fù)蘇菌液接種于上述不同濃度的豬膽鹽溶液中，37℃作用3 h后，涂布平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以處理前細(xì)菌數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率（趙瑞香等，2004）。

1.2.7 抑菌性試驗(yàn) 將致病菌分別培養(yǎng)12～24h，按20倍稀釋?zhuān)?00 μL致病菌液均勻涂布到事先準(zhǔn)備好的無(wú)菌瓊脂平板上。采用牛津杯法，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)12～24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，以無(wú)菌普通液體培養(yǎng)基作對(duì)照 （郭志杰等，2010）。

2 結(jié)果

2.1 芽孢乳酸菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果 由圖1可知，芽孢乳酸菌未經(jīng)過(guò)遲緩期，直接進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，0～6 h生長(zhǎng)速度最快，6～18 h生長(zhǎng)速率減緩，18～26 h生長(zhǎng)速率有所提高，26～34 h生物量變化不明顯，達(dá)到穩(wěn)定期，34 h生物量開(kāi)始降低，進(jìn)入衰亡期。

2.2 芽孢乳酸菌的產(chǎn)酸能力測(cè)定結(jié)果 由圖2可知，0～10 h芽孢乳酸菌產(chǎn)酸能力非常強(qiáng)，培養(yǎng)液的pH迅速降低，10～12 h培養(yǎng)液pH有短暫的回升，然后又繼續(xù)降低，32 h pH為3.60，此時(shí)pH降到最低。之后pH逐漸升高，最后pH在3.80左右趨于穩(wěn)定。

圖1 芽孢乳酸菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

圖2 芽孢乳酸菌產(chǎn)酸能力測(cè)定結(jié)果

2.3 芽孢乳酸菌的高溫耐受性試驗(yàn)結(jié)果 由圖3可知，對(duì)芽孢乳酸菌進(jìn)行高溫處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在60℃處理10 min后存活率達(dá)94.37%，90℃處理10 min后存活率高達(dá)70%以上，說(shuō)明芽孢乳酸菌對(duì)高溫有較好的耐受性。

圖3 芽孢乳酸菌高溫耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 芽孢乳酸菌的耐酸性試驗(yàn)結(jié)果 益生菌要到達(dá)腸道發(fā)揮作用，必須經(jīng)過(guò)胃酸的作用，因此其必須具有良好的耐酸能力，才能到達(dá)腸道發(fā)揮功能。由圖4可知，對(duì)該芽孢乳酸菌進(jìn)行酸處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在pH 2.0環(huán)境中存活率高達(dá)54.69%，說(shuō)明芽孢乳酸菌具有較好的耐酸特性。

2.5 芽孢乳酸菌的耐膽鹽試驗(yàn) 結(jié)果 益生菌到達(dá)十二指腸時(shí)要受到膽鹽的抑制作用，因此必須有較高的膽鹽耐受性，才能發(fā)揮益生特性。由圖5可知，對(duì)該芽孢乳酸菌進(jìn)行膽鹽處理后發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌在0.2%豬膽鹽溶液中存活率在90%以上，在1.0%的豬膽鹽溶液中存活率超過(guò)20%，說(shuō)明芽孢乳酸菌具有較強(qiáng)的耐膽鹽特性。

圖4 芽孢乳酸菌耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

圖5 芽孢乳酸菌耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

2.6 芽孢乳酸菌的抑菌性試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，芽孢乳酸菌對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，其中對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為19.76 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性最弱，但抑菌圈直徑也較大?？傮w看來(lái)，芽孢乳酸菌對(duì)腸道常見(jiàn)致病菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

表1 芽孢乳酸菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

益生菌通過(guò)添加到飼料進(jìn)入胃腸道,在胃腸道中定殖,并能通過(guò)大量繁殖的有益菌發(fā)揮其益生作用。研究表明,理想的益生菌應(yīng)具有生長(zhǎng)速度快、對(duì)胃腸道環(huán)境(胃酸、膽鹽等)耐受能力強(qiáng),具有一定的抑菌能力等特點(diǎn) （Geimonde和Salminen，2006）。 Hyronymus等（2000）研究報(bào)道,芽孢乳酸桿菌、左旋乳酸芽孢桿菌、消旋乳酸芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌在pH 2.0中生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈的抑制。Guo等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，中低質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽(≤0.3%)對(duì)芽孢桿菌的存活影響很??；而高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膽鹽（>0.3%）對(duì)不同來(lái)源菌株的耐受能力就表現(xiàn)出明顯的差異（王煥等，2008）。芽孢桿菌的抑菌作用，不同菌株各有不同。王德培等（2010）對(duì)分離到的1株枯草芽孢桿菌的抑菌譜進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該枯草芽孢桿菌具有廣譜抗真菌活性。陳家祥等（2010）研究報(bào)道，加地衣芽孢桿菌有益于肉雞的腸道發(fā)育，能夠抑制盲腸內(nèi)有害菌的生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)表明，此株芽孢乳酸菌具有較好的生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸能力，在24 h之后會(huì)逐步進(jìn)入穩(wěn)定期，最終pH值會(huì)達(dá)到3.80左右，這有利于在消化道內(nèi)定植后快速生長(zhǎng)及維持消化道的酸性環(huán)境。此外，芽孢乳酸菌具有優(yōu)良的生物學(xué)特性，可耐受90℃高溫，有利于微生態(tài)添加劑的生產(chǎn)；能耐受pH 2.0的酸性環(huán)境，存活率達(dá)到50%以上，使芽孢乳酸菌能順利通過(guò)胃內(nèi)酸性環(huán)境到達(dá)腸道發(fā)揮生物學(xué)功能；對(duì)豬膽鹽溶液也有較高的耐受性，在發(fā)揮功能的同時(shí)免受豬膽汁酸的抑制作用。從整體水平可以看出，此株芽孢乳酸菌具有較好的生物學(xué)功能，可以作為微生態(tài)飼料添加劑生產(chǎn)使用。

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