張海珠，鄧水來，張海，馬媛，周萍

(大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理671000)

泡核桃Juglans sigillataD.又名漾濞核桃、茶核桃、鐵核桃，系胡桃科Juglandaceae胡桃屬Juglans植物。種植較廣泛，主要分布于云南［1］、貴州、四川西部等，生長于海拔1 300～3 300 m山坡或山谷林中［2］。但核桃殼在核桃加工過程中一般作為廢物棄掉或焚燒，造成嚴(yán)重污染環(huán)境，利用價值極低。隨著環(huán)境、能源問題突現(xiàn)，開始重視核桃殼的研究。鄭志鋒等［3］研究了核桃殼的化學(xué)組分及不同品種、不同產(chǎn)地核桃殼化學(xué)組分的變異，為核桃殼這一廢棄性再生資源的利用提供依據(jù)。核桃中含有大量的苷類、鞣質(zhì)、沒食子酸、揮發(fā)油等，具有消炎、收斂、生肌、瀉下等作用，可用于口腔潰瘍的治療。除此之外，核桃殼由于本身的硬度，經(jīng)特殊的物理化學(xué)處理可以制成核桃殼濾料，核桃殼活性碳以及一些工藝制品［4～8］。對核桃殼多糖的組成單體——單糖的測定尚未見報道。

1 試驗儀器及材料

1.1 儀器Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，包括G1315A/B PAD檢測器，G1315A ALS自動進(jìn)樣器;AE240天秤(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);HH—S2s數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠);SZ—1快速混勻器(金壇市金城國勝實驗儀器廠);LDZ4—0.8自動平衡微型離心機(北京醫(yī)用離心機)。

1.2 試藥D-葡萄糖醛酸(批號:14068-200602)，D-甘露糖(批號:140651-200602)、半乳糖(批號:100226-200404)、D-阿拉伯糖(批號:1506-200203)、鼠李糖(批號:111683-200402)、D-半乳糖醛酸(批號:111646-200301)、葡萄糖(批號:111648-200406)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙酸銨(優(yōu)級純)，乙腈(色譜純，美國Tedia試劑公司)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)，冰乙酸均為分析純，水為超純水。泡核桃采集自云南省大理州漾濞縣，由大理學(xué)院生藥學(xué)教研室周濃副教授鑒定為胡桃科胡桃屬植物泡核桃Juglans sigillata D.。

2 樣品測定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Agilent Venusil XBP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-醋酸銨緩沖液(醋酸銨-冰醋酸，pH 5.5)(19∶81)，檢測波長為250 nm，柱溫為30℃，體積流量為1 mL/min。對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣體積10 μL。單糖HPLC色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms for identification

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備取80℃干燥至恒定質(zhì)量的D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、D-阿拉伯糖對照品各4.35、4.18、4.39、4.75、4.59、4.27、4.05 mg，置2 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，即得7種單糖的對照品混合貯備液(各種單糖的質(zhì)量濃度約為2.0 mg/mL)。取單糖對照品混合貯備液200 μL于2 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至刻度，搖勻，即得0.20 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備泡核桃殼經(jīng)10%NaOH浸泡24 h后，用冰醋酸調(diào)pH為中性，加1、2、4、6倍乙醇沉淀得到C、D、E、F提取物。精密稱取4種提取物各20 mg，置于安瓿管中，注入2 mol/L三氟乙酸(TFA)水溶液2 mL，放入水浴鍋中，沸水浴水解8 h，取出反應(yīng)物，冷卻至室溫，加入NaOH溶液(2 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至7.0，即得供試品溶液。

2.3 衍生化產(chǎn)物的制備［9］精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液和供試品溶液各200 μL，依次加入0.3 mg/L NaOH 50 μL和0.5 mol/L PMP甲醇溶液50 μL，混勻，70℃水浴反應(yīng)40 min，取出反應(yīng)物，冷卻至室溫后，加入0.3 mol/L HCl溶液50 μL中和。加入200 μL三氯甲烷萃取，渦旋，離心收集上層，取上層水相，即得到衍生化后的混合單糖對照品溶液與核桃殼多糖水解樣品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別精密量取0.2 mg/mL的對照品溶液和2.0 mg/mL的對照品貯備液各50 μL、100 μL、200 μL置2 mL量瓶中，加水定容，搖勻，得系列質(zhì)量濃度的對照品混合溶液。分別取200 μL各對照品溶液按2.3項下方法進(jìn)行衍生化處理，制備不同質(zhì)量濃度的線性工作液，在2.1項色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL測定峰面積。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖、半乳糖、D-阿拉伯糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖的回歸方程及其線性關(guān)系見表1。

表1 7種單糖的線性范圍和回歸方程Tab.1 Linear range and regression equation of calibration curve of 7 kinds of monosaccharide

2.4.2 儀器精密度試驗取質(zhì)量濃度為0.020 mg/mL的單糖混合對照品按2.3項下方法進(jìn)行衍生化處理后，在上述色譜條件下精密吸取10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各種單糖對應(yīng)的峰面積，測定結(jié)果表明D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、D-阿拉伯糖的峰面積RSD分別為:0.90%、1.02%、2.10%、1.82%、1.20%、0.85%、0.66%，符合分析要求。2.4.3重復(fù)性試驗精密稱取泡核桃殼F樣品6份，按2.2.2項下進(jìn)行水解操作，再按2.3項下方法進(jìn)行衍生化處理，按2.1項色譜條件，進(jìn)樣10 μL測定，計錄色譜峰面積，計算D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、D-阿拉伯糖的峰面積的RSD分別為:2.26%、2.65%、1.88%、2.14%、1.34%、2.89%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗取2.3項下泡核桃殼F樣品溶液衍生化產(chǎn)物，按2.1項下色譜條件，于0、2、4、8、12 h分別測定樣品峰面積，計算樣品中各單糖的峰面積的RSD分別為D-甘露糖1.27%、鼠李糖7.75%、D-葡萄糖醛酸2.33%、D-半乳糖醛酸1.49%、葡萄糖1.81%、半乳糖0.84%、D-阿拉伯糖1.11%，說明供試品溶液中除了鼠李糖穩(wěn)定性稍差外，其他單糖在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收試驗稱取泡核桃殼F樣品9份，每份約10 mg，精密稱定，置安瓿管中，分別加入不同量的含有D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖、D-木糖、果糖、半乳糖、D-阿拉伯糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖的單糖混合對照品溶液，制備低、中、高不同濃度的供試品溶液，每一濃度3份，按2.2.2項下進(jìn)行水解操作，再按2.3項下方法進(jìn)行衍生化處理，在上述色譜條件下，吸取10 μL進(jìn)樣進(jìn)行測定，計錄色譜峰面積，分別進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、D-阿拉伯糖的平均回收率分別為95.9%、103.1%，104.6%、97.5%、95.8%、87.5%、98.1%，RSD分別為2.66%、2.35%、1.92%、1.87%、2.14%、2.89%、2.72%。由結(jié)果可知回收率較好，方法可行。

2.5 樣品測定取泡核桃殼提取的C、D、E、F組分20 mg各3份，精密稱定，分別按2.2.2項下進(jìn)行水解操作，再按2.3項下方法進(jìn)行衍生化處理，在上述色譜條件下，進(jìn)樣10μL測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時間確定核桃殼多糖中含有D-葡萄糖酸、D-甘露糖、半乳糖、D-阿拉伯糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖。在核桃殼C組分中9號峰為未知糖;在核桃殼D、E組分中，9號、10號、11號和12號峰為未知糖;在核桃殼F組分中，9號、10號和12號為未知糖。以本實驗的7種已知糖的總量為100%，根據(jù)所測得的峰面積計算核桃殼C、D、E、F中所含幾種糖的相對平均含有量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 衍生化試劑的選擇糖既沒有紫外吸收，也不產(chǎn)生熒光，因此本實驗采用衍生化方法來對糖進(jìn)行分析，建立了核桃殼多糖中單糖的組成和含有量的檢測方法。通過適宜的衍生化方法和適合的高效液相色譜法分析條件，進(jìn)行試驗，得到較好的分離分析效果。目前糖的色譜檢測方法，大多數(shù)采用衍生化后直接檢測的方式。糖自身所具有的衍生化基團(tuán)包括羥基、醛基或酮基等，可以實現(xiàn)還原或選擇性酰胺化衍生操作，還可以通過縮合等反應(yīng)衍生［10-11］。PMP柱前衍生化高效液相色譜分析單糖的方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度較高，可同時進(jìn)行多種單糖檢測分離，且各單糖間具有理想的分離度，不僅可以檢測出中性糖，而且還可同時檢測糖醛酸和堿性糖，并可進(jìn)行定量分析，適合于單糖組成較為復(fù)雜的多糖樣品分析。取樣量少，且具有簡易、實用等特點，適用于微量多糖樣品的單糖組成及含量的測定。

表2 漾濞泡核桃核桃殼C、D、E、F組分中單糖組成及相對平均含有量Tab.2 Average contents of polysaccharide C、D、E and F in walnut shell from Yangbi Yunnan

3.2 有機萃取劑體積的選擇柱前衍生需使用過量的衍生化試劑以達(dá)到衍生化完全的目的，但若衍生化試劑隨樣品進(jìn)入HPLC不但會影響實驗結(jié)果，而且還會損壞色譜柱。因此在進(jìn)樣之前必須除去過量的衍生化試劑，以清除衍生化試劑的干擾，延長色譜柱的使用壽命。有機萃取溶劑多為三氯甲烷，用量在100 μL～300 μL之間［12-13］，本實驗通過不同體積萃取溶劑對實驗結(jié)果影響的條件考察，最終確定有機萃取溶劑體積為200 μL時，對實驗結(jié)果的影響最小。

3.3 本實驗確定了云南漾濞泡核桃殼提取物C、D、E、F組分中單糖的組成和含有量，發(fā)現(xiàn)C、D、E組分均含有D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、D-阿拉伯糖，F(xiàn)組分中除D-葡萄糖醛酸外含有其余的6種單糖，在檢測到的7種單糖中D-阿拉伯糖的相對平均含有量最高，并且又標(biāo)記出4種未知的單糖。本實驗組前期研究發(fā)現(xiàn)云南漾濞泡核桃殼提取物C、D、E、F組分均具有良好的抗病毒活性，其這一活性作用和其所含有的單糖成分之間是否存在一定的關(guān)系還要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

通過本次實驗，為核桃殼的充分利用提供了一定的理論依據(jù)。同時也對云南漾濞泡核桃殼的研究利用提供一定的參靠價值，有利于核桃殼研究的進(jìn)一步發(fā)展。本次試驗的單糖定量測定方法，不僅可提供核桃殼多糖的單糖組成的基本信息，且可推廣應(yīng)用到其他多糖組成的分析。

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