袁海建， 程林兵， 蔡寶昌， 李俊松， 陳宜剛

(1.泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州225300;2.國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210029;3.福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002)

月腺大戟為大戟科Euphorbiaceae大戟屬Euphorbia月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata．的塊狀根，是中藥狼毒的原植物之一。具有抑菌殺蟲［1-2］作用，民間還用于抗結(jié)核［3］和抗腫瘤［4-5］等。近年來的研究［6］表明，其主要有效成分［7］有狼毒乙素、狼毒丙素等化合物。為了更好的控制狼毒藥材的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)報(bào)道了月腺大戟中狼毒乙素、狼毒丙素兩種有效成分的HPLC的分析方法，在實(shí)際樣品的分析中取得了滿意的結(jié)果。

1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，包括柱溫箱、在線脫氣機(jī)、四元泵及二極管陣列檢測器 (美國 Agilent公司);AG285電子天平 (瑞士METTLER公司);KQ—500E型超聲清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

狼毒乙素對(duì)照品、狼毒丙素對(duì)照品 (江蘇省中國科學(xué)院植物研究所惠贈(zèng)，純度＞99%);月腺大戟藥材 (分別購自亳州藥材總公司，批號(hào):100606、100822，南京同仁堂藥 業(yè) 有 限 公 司， 批 號(hào):2010100060、2010090020、2010090060、2010100010)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定均為月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata．正品;乙腈 (美國Tedia公司，色譜純)，純凈水 (娃哈哈有限公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分析條件 Welchrom-C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫30℃;流動(dòng)相為乙睛 (A)-水 (B)梯度洗脫，0～11 min，25%A，75%B;11～12min，25% ～45%A，75% ～55%B;12～20min，45% ～70%A，55% ～30%B;20～21 min，70% ～25%A，30% ～75%B。體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;檢測波長290 nm。按照上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示狼毒乙素、狼毒丙素與其他雜質(zhì)峰得到很好的分離。各成分理論塔板數(shù)不低于4 500。見圖1。

圖1 對(duì)照品 (A)和藥材 (B)HPLC色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 取各樣品粉末 (過三號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，精密稱定質(zhì)量，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再精密稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取狼毒乙素、狼毒丙素3.00、3.90 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，搖勻，即得狼毒乙素、狼毒丙素標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取狼毒丙素貯備液5 mL，狼毒乙素貯備液5 mL，至10 mL量瓶中，即得對(duì)照品溶液。

2.4 線性考察 精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、2.4、3.5 mL，分別加甲醇定容至10 mL。分別吸取上述對(duì)照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積;以進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得狼毒乙素的線性范圍為0.000 3～0.21μg，回歸方程為Y=6×106X+4.225 8，r=0.999 9;狼毒丙素的線性范圍為0.003 9～0.273μg，回歸方程為Y=2×106X+10.734，r=0.999 9。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，分別含狼毒乙素0.010 5 mg/mL、狼毒丙素0.013 65 mg/mL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，2種物質(zhì)在此測定方法下，測得狼毒乙素峰面積的RSD值為0.012%，狼毒丙素峰面積的RSD值為0.037%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在上述色譜條件下，取同一供試品溶液，分別在保存0、2、4、6、12、24 h進(jìn)行測定，測定峰面積，2種物質(zhì)在此測定方法下，測得狼毒乙素峰面積的RSD值為1.11%，狼毒丙素峰面積的RSD值為1.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一月腺大戟藥材 (亳州藥材公司-1)粉末 (過三號(hào)篩)，按供試品制備方法，平行制備6份，進(jìn)行測定，計(jì)算狼毒乙素、狼毒丙素的的含有量，RSD分別為1.30%、1.54%，表明該測定方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測定的月腺大戟藥材(亳州藥材公司-1)粉末 (過三號(hào)篩)，共6份，各約1g，精密稱定，分別精密加入狼毒乙素、狼毒丙素對(duì)照品，按照供試品溶液制備，測定含有量并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 狼毒乙素、狼毒丙素加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定 精密稱取不同供應(yīng)商、不同批次月腺大戟藥材粉末各2.0 g(過三號(hào)篩)，按照2.2項(xiàng)供試品制備方法制備，以20 μL進(jìn)樣，測定色譜峰峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 狼毒乙素和狼毒丙素具有相同的母核，結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［8-9］，實(shí)驗(yàn)通過使用DAD檢測器，對(duì)被測物質(zhì)進(jìn)行了全波長掃描，考察了狼毒乙素、狼毒丙素最大吸收峰情況。結(jié)果表明，狼毒乙素的最大吸收峰在293 nm左右，狼毒丙素的最大吸收峰在288 nm左右。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇的檢測波長為290 nm，實(shí)際檢測結(jié)果顯示，效果較好。

表2 樣品測定結(jié)果 (n=3)

3.2 流動(dòng)相的選擇 狼毒乙素和狼毒丙素具有相同的母核［10］，因母核上取代基的不同造成極性略有差異，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過多次調(diào)整梯度洗脫時(shí)流動(dòng)相比例、體積流量、柱溫、最終篩選出使各成分能夠較好分離的色譜條件。

3.3 藥材提取方法考察［11-12］實(shí)驗(yàn)采用單因素法，考察了水、甲醇、1%乙酸-95%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、70%甲醇不同提取溶劑對(duì)狼毒乙素和狼毒丙素提取效率的影響，結(jié)果顯示甲醇提取效率較高;比較了回流、冷浸、超聲3種提取方法，結(jié)果表明超聲提取效果較好;比較了超聲提取20、30、40 min的提取效果，結(jié)果表明隨著超聲時(shí)間的延長，提取效率提高，但是到達(dá)一定時(shí)間后，其提取效率不再提高，故選擇超聲提取30 min;比較了25、50、75倍提取溶劑對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示用50倍量提取液的提取效果較好。

致謝:承江蘇省中國科學(xué)院植物研究所張涵慶研究員惠贈(zèng)對(duì)照品并給予指導(dǎo)。

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