黃福生，黎漢忠，劉志輝，王洪學，李永強※

(1.扶綏縣人民醫(yī)院普外科，廣西扶綏532100;2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院化療一科，南寧530021)

乳腺癌為常見的人類惡性腫瘤。在西方發(fā)達國家，乳腺癌為最常見的女性惡性腫瘤［1］。傳統觀點認為我國屬于乳腺癌相對低發(fā)地區(qū)，然而近年來我國乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢［2］，這種態(tài)勢在生活水平高的地區(qū)尤為明顯。據統計，乳腺癌發(fā)病率已居我國女性惡性腫瘤的第2位，在沿海經濟發(fā)達地區(qū)已經成為發(fā)病率居首的女性惡性腫瘤。手術切除是治療乳腺癌的基本手段，但部分具有遠處侵襲傾向，惡性程度高的乳腺癌患者出現術后復發(fā)，并且往往對術后放化療相對不敏感，而遠處轉移是這部分患者死亡的主要原因。因此，尋找可早期判斷轉移傾向的分子標志物，乃至探索預防轉移的有效干預點顯得尤為迫切。眾多研究已經表明腫瘤細胞從靜息狀態(tài)到轉移侵襲的激活，其所處的局部微環(huán)境發(fā)揮了決定性的作用。腫瘤間質是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，腫瘤間質分泌的各種蛋白酶調節(jié)著腫瘤細胞的功能狀態(tài)。本課題研究了激肽釋放酶相關肽6 (kallikrein-related peptidase 6，KLK6)對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231遷移及侵襲運動的影響及其高表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞培養(yǎng)液及其試劑 細胞培養(yǎng)采用的胎牛血清為杭州四季青公司產品; DMEM培養(yǎng)基，D-Hanks緩沖液為美國Introvigen公司產品;胰蛋白酶為美國Amresco公司產品。細胞培養(yǎng)液由10%胎牛血清加入DMEM培養(yǎng)基中制備而成，每升培養(yǎng)液含青霉素1×105U及鏈霉素0.1 g。將胰蛋白酶(終濃度0.25%)溶于D-Hanks液后過濾除菌后用于細胞消化傳代。人激肽釋放KLK6重組蛋白購于美國My-BioSource公司，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實驗用細胞株及乳腺癌組織收集 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中南大學湘雅中心實驗室。細胞常規(guī)置于37℃含5%的CO2的細胞培養(yǎng)箱中。收集2009年11月至2010年12月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院或廣西壯族自治區(qū)扶綏縣人民醫(yī)院手術切除的29例乳腺癌組織標本，所有樣本均由病理診斷證實，且均為第1次手術治療，未經放化療等其他治療。所收集組織標本取得患者知情同意。

1.1.3 Transwell實驗用培養(yǎng)板及細胞外基質 12孔嵌入式細胞培養(yǎng)板(直徑10.5 mm，孔徑8 μm)為美國BD Biosciences公司產品。該培養(yǎng)板分為嵌入式的上小室與底部的下室，上小室與下室之間由聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)膜相隔，8 μm的孔徑可容細胞通過。細胞外基質購于美國BD Biosciences公司，用于實驗前預處理并覆蓋PET膜。

1.1.4 反轉錄-聚合酶鏈反應試劑 TRIzol與反轉錄試劑盒分別購于美國Invitrogen及Promeag公司，TaKaRa Ex Taq耐熱性DNA聚合酶為上海生工生物工程公司產品，引物委托上海生工生物工程公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 劃痕試驗 細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至細胞相互融合鋪滿整個培養(yǎng)皿后，用無菌普通槍頭在培養(yǎng)皿均勻劃痕。無菌PBS緩沖液沖洗3次，換入新鮮培養(yǎng)液，處理組含40 nmol/L人KLK6重組蛋白，該濃度參考以往文獻［3］，對照組加入等量DMSO。拍照并觀察細胞于劃痕處的遷移情況，12 h及24 h后重新于同一視野重新拍照，運用 Quantitative Wound Healing Image Analysis(德國Ibidi公司)在線分析軟件，以細胞覆蓋劃痕處的百分率定量評價細胞的遷移能力。隨機選取6處視野，通過比較兩組間均數評價其統計學意義。

1.2.2 Transwell細胞侵襲實驗 105的MDA-MB-231細胞重懸于10-3/L的無血清DMEM培養(yǎng)液中并接種于上小室，下室放置含10%血清的DMEM培養(yǎng)液。處理組上小室及下室含40 nmol/L人KLK6重組蛋白，處理組加入等量DMSO作為對照，每組6復孔。24 h后移去上小室，4%甲醛用于固定進入下室的細胞，結晶紫染色液染色，Quantity One軟件(美國Bio-Rad公司)測量細胞數，計算24 h后通過PET膜進入下室的細胞數，定量分析處理組與對照組的細胞侵襲能力。

1.2.3 半定量反轉錄-聚合酶鏈反應 按Trizol試劑盒說明提取29例乳腺癌手術切除標本的總RNA，按反轉錄試劑盒說明合成cDNA。寡聚核苷酸引物: (KLK6，正義鏈，5'-GAAGCATAACCTTCGGCAAA-3';反義鏈，5'-GGGAAATCACCATCTGCTGT-3')，內參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，正義鏈，5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';反義鏈，5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')。聚合酶鏈反應擴增反應條件:預變性94℃ 5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個循環(huán)，72℃延伸4 min (聚合酶鏈反應儀為美國Thermo公司產品)。反應結束后，取聚合酶鏈反應產物各5 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像分析系統掃描。ImageJ軟件取得各樣本電泳條帶灰度值，利用各樣本KLK6/ GAPDH的比值半定量評估KLK6在各樣本中的表達高低。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，兩獨立樣本均數t檢驗用于檢驗組間差異，Fisher確切概率法用于檢驗KLK6高表達與臨床特征的關系，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KLK6對MDA-MB-231細胞遷移活動的影響細胞劃痕試驗顯示在處理12 h后，處理組的細胞覆蓋面積為59.3%，而對照組為52.2%，處理組細胞覆蓋面積大于對照組，但并無統計學意義;在處理24 h后再次觀察，處理組的細胞覆蓋面積為84.4%，而對照組為64.7%(圖1)，表明人激肽釋放KLK6重組蛋白明顯促進了MDA-MB-231細胞的遷移活動。

2.2 KLK6對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響人KLK6重組蛋白同時加入處理組上小室與下室，對照組加入等量不含重組蛋白的DMSO。24 h后細胞計數顯示，處理組進入下室的細胞數平均為(589± 25)個，而對照組為(474±37)個(圖2)，處理組明顯多于對照組，具有統計學意義(t=6.3083，P＜0.05)，顯示激肽釋放KLK6增強MDA-MB-231細胞侵襲能力。

2.3 KLK6高表達與臨床特征的關系 半定量反轉錄-聚合酶鏈反應結果顯示KLK6在29例乳腺癌原發(fā)灶組織中的灰度比值最大值為0.75，最小值為0.25，中位數為0.45，均數為0.44。以≥0.5定義為高表達，分析KLK6與諸臨床特征的關系。所有臨床分期均根據美國癌癥聯合委員會于2003年頒布的乳腺癌TNM分期(第6版)。統計學分析顯示，KLK6高表達與年齡、T分期、M分期無關，與N分期，即淋巴轉移有關(表1)。

表1 KLK6高表達與臨床特征的關系 ［例(%)］

3 討論

KLK6屬于激肽釋放酶相關肽家族成員，該家族作為分泌糜蛋白酶和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶代表，在各種生理及病理條件下表達，包括各種人類腫瘤［4-6］。以往研究表明通過轉染技術使KLK6在小鼠角質細胞株中異位表達，可破壞細胞間的黏附，加速細胞增殖并增強其遷移、侵襲能力［7］。由于乳腺癌的預后與是否發(fā)生淋巴結及遠處轉移密切相關，本課題研究了人重組KLK6蛋白在體外對乳腺癌細胞株MDA-MB-231遷移及侵襲能力的影響，并研究了其在原發(fā)腫瘤中高表達的臨床意義。

劃痕試驗是經典的評估體外細胞遷移能力的方法，操作簡便，而本研究進一步通過計算12 h和24 h遷移細胞覆蓋劃痕處的百分率來定量評價其遷移活動，比傳統僅僅通過肉眼觀察更為客觀可信。本研究還運用Transwell細胞侵襲實驗來驗證KLK6在體外對MDA-MB-231細胞侵襲能力的增強。Transwell實驗是近年來發(fā)展起來的可用于評估細胞侵襲能力的實驗模型，由于在放置細胞的上小室并沒有血清，具有侵襲傾向的MDA-MB-231細胞會向含有血清營養(yǎng)成分的下室運動，與普通的遷移實驗不同的是，分隔上下小室的PET膜預先包被了細胞外基質，以模仿體內細胞外基質，細胞若進入下室，則先要分泌基質金屬蛋白酶將基質膠降解，方可通過PET膜，這與腫瘤細胞在體侵襲過程是一致的。結果顯示，KLK6不僅明顯促進了MDA-MB-231細胞的遷移，而且增加了MDA-MB-231細胞的侵襲能力。體外實驗提示KLK6表達可能與乳腺癌的轉移有關，為此進一步研究了KLK6在乳腺癌組織的表達與臨床特征的關系。統計學分析顯示，KLK6高表達組的病例其淋巴轉移率明顯高于低表達組，提示KLK6高表達與乳腺癌的轉移傾向密切相關。Breitenbach等［8］報道了在化學藥物誘導的小鼠皮膚癌中，KLK6的高表達出現在進展期的腫瘤組織中，而在 Klucky等［7］的報道中，KLK6的異常高表達也與人類皮膚癌的臨床進展有關。這些研究的結論與本研究的結果相一致，提示KLK6可能是一個通過增加乳腺癌細胞遷移、侵襲能力而促進乳腺癌發(fā)展的腫瘤相關蛋白。一項新近的報道初步探討了KLK6作用于腫瘤微環(huán)境的具體通路及機制［3］，而通過將來更為深入的研究，KLK6不僅可能成為一個具有臨床診斷意義的蛋白分子，也有望成為一個潛在的乳腺癌治療的基因靶點。

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