王 鑄， 曹開源△， 何 霞， 馮發(fā)深， 徐 霖， 關(guān)琳琳， 汪 楊， 羅燕芬， 丘少鵬

(中山大學(xué)1臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，2中山醫(yī)學(xué)院微生物教研室，3附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510080)

前列腺癌(prostate cancer)是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。在全世界男性癌癥患者中，前列腺癌患病率居第3位［1］，由于其發(fā)病隱匿，早期診斷困難，對晚期轉(zhuǎn)移癌患者尚無有效治療手段，預(yù)后較差。前列腺特異性膜抗原(prostate－specific membrane antigen，PSMA)作為前列腺癌較特異的生物學(xué)標(biāo)志物以及診斷和治療的潛在靶點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注［2－3］。已證實(shí) PSMA具有較高的前列腺癌特異性，在前列腺癌中高表達(dá)，在低分化、進(jìn)展期、激素難治性及轉(zhuǎn)移性的前列腺癌中表達(dá)進(jìn)一步增高，是前列腺癌診斷和治療研究的理想靶點(diǎn)［2］。PSMA在前列腺癌中的高表達(dá)及與其病理分級、預(yù)后因素的相關(guān)性提示PSMA在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中可能起著調(diào)控作用。本課題組通過RNAi技術(shù)沉默PSMA基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LNCaP細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，而生長能力沒有明顯變化，初步發(fā)現(xiàn)PSMA在前列腺癌轉(zhuǎn)移過程中起負(fù)調(diào)控作用［4］。

本文應(yīng)用siRNA技術(shù)對前列腺癌LNCaP細(xì)胞株P(guān)SMA基因產(chǎn)生特異性沉默，并通過腫瘤轉(zhuǎn)移基因芯片技術(shù)對84個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行了分析。旨在了解PSMA在前列腺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用以及其參與的相關(guān)調(diào)控信號通路，為探索前列腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的思路，從而為臨床腫瘤的轉(zhuǎn)移診斷、預(yù)后及治療提供理論參考。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞LNCaP購自ATCC(美國模式培養(yǎng)物集存庫)，用含有10%的胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

2 主要試劑

Lipofectamine 2000試劑盒、Trizol以及一步法熒光定量試劑盒均購自Invitrogen。RPMI－1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco。

3 RNAi序列設(shè)計(jì)

針對前列腺癌LNCaP細(xì)胞PSMA mRNA序列(M99487)利用在線設(shè)計(jì)軟件(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/siRNA_search.cgi?tasto =10925811)設(shè)計(jì)了3對特異性siRNA序列，見表1。

4 RNAi序列轉(zhuǎn)染

在轉(zhuǎn)染的前1 d，按照2.0×105cells/well的密度接種LNCaP細(xì)胞到6孔板，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度達(dá)到30～50%的匯合度。轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，轉(zhuǎn)染操作步驟按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h 和96 h，收取細(xì)胞。

5 RT－PCR檢測RNAi干擾PSMA的表達(dá)效果

采用Beacon Designer 7.01 Demo設(shè)計(jì)軟件針對PSMA基因設(shè)計(jì)特異性探針和引物，見表2。以βactin作為內(nèi)參照。

Trizol法提取各細(xì)胞樣品總RNA，取3 μL作為模板進(jìn)行RT－PCR檢測。反應(yīng)條件:50℃逆轉(zhuǎn)錄過程15 min;95℃預(yù)變性 2 min，95℃ 15 s，60℃30 s，共50個(gè)循環(huán)。

表1 針對PSMA基因的特異siRNA序列Table 1.Nucleotide sequences of the PSMA－targeting siRNA

表2 PSMA和β－actin的Taqman探針和引物Table 2.Taqman probe and primer for PSMA and β － actin

6 siRNA干擾下的腫瘤轉(zhuǎn)移基因芯片分析

采用SABiosciences公司腫瘤轉(zhuǎn)移基因芯片［PCR Array Human Tumor Metastasis(PAHS－028A)，http://www.kangchen.com.cn/Product/Productmain.asp?ID=41］。該芯片采用熒光定量PCR原理，具有高靈敏度、高特異性、重復(fù)性好和線性范圍廣的特性，是研究特定信號通路或者一組功能相關(guān)基因表達(dá)量的理想方法。

本研究采用的腫瘤轉(zhuǎn)移基因芯片應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)準(zhǔn)確檢測了96個(gè)基因的表達(dá)情況，其中內(nèi)參照基因4個(gè)，質(zhì)控基因8個(gè)，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因84個(gè)。

計(jì)算每個(gè)處理組中的每個(gè)通路相關(guān)基因的ΔCt值。ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)=靶基因平均Ct值－內(nèi)參照基因平均Ct值;ΔCt(對照組)=靶基因平均Ct值－內(nèi)參照基因平均Ct值。

計(jì)算2個(gè)PCR Array(或2組)中每個(gè)基因的ΔΔCt。ΔΔCt= ΔCt(實(shí)驗(yàn)組) － ΔCt(對照組)。通過2－ΔΔCt計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組對應(yīng)基因的表達(dá)差異，對存在顯著差異的實(shí)驗(yàn)結(jié)果自行設(shè)計(jì)引物通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料進(jìn)行單因素方差分析，方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)分析，樣本間的兩兩比較采用LSD方法分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RNAi干擾PSMA表達(dá)效果檢測

經(jīng)過RT－PCR檢測分析確定siRNA 3干擾序列在干擾濃度為50 nmol/L，RNA干擾時(shí)間為72 h時(shí)的效果最好，ΔΔCt為2.13，PSMA mRNA 水平干擾效果達(dá)到75%以上，Western blotting顯示PSMA在蛋白水平下調(diào)表達(dá)68%，差異顯著(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Results of RNAi efficiency of siRNA 3.±s.n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖1 siRNA 3序列干擾效果

2 腫瘤轉(zhuǎn)移基因芯片檢測結(jié)果

siRNA干擾PSMA基因表達(dá)的LNCaP細(xì)胞組和正常對照組相比，有CDH6、CXCL12等10個(gè)基因發(fā)生顯著上調(diào)表達(dá)，而MDM2、MMP2等4個(gè)基因發(fā)生顯著下調(diào)表達(dá)，見圖2、表3。

Figure 2.Tumor metastasis－related gene expression in the RNAi－ PSMA LNCaP cells.圖2 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在siRNA干擾PSMA基因表達(dá)條件下的表達(dá)

討 論

PSMA 由 Horoszewicz等［5］于 1987 年用單抗7E11－C5對人各種器官的正常及惡性組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，為獨(dú)特完整的橫跨細(xì)胞膜的二型前列腺上皮細(xì)胞糖蛋白，同時(shí)還是一個(gè)大分子金屬肽酶。PSMA由750個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為100～120 kD，其基因定位于11q14，11號染色體短臂上，共有19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子［6］。PSMA和Folh1酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白等一些基因高度同源，且存在多種剪接變異體［7－8］。PSMA具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和受體功能，在細(xì)胞營養(yǎng)攝取、細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮作用［9］，并和染色體穩(wěn)定性有關(guān)［10］。

目前，和PSMA相關(guān)的調(diào)控蛋白最重要的發(fā)現(xiàn)之一是filamin A蛋白。Filamin A是PSMA和PAK之間很重要的紐帶。有報(bào)道稱PSMA與激活RAC1可能高度相關(guān)［11］。RAC1激活下調(diào)了E－鈣黏蛋白的表達(dá)，使得細(xì)胞之間的黏附變得疏松從而有利于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。PSMA受到整合素蛋白以及PAK的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。激活的PAK和filamin相互作用，導(dǎo)致filamin A的2 152位Ser被磷酸化，導(dǎo)致PAK的進(jìn)一步激活［11］。有研究發(fā)現(xiàn)PSMA在細(xì)胞偽足結(jié)構(gòu)中有積累，但目前還不確定PSMA在細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制［12］。

本課題組通過RNAi技術(shù)沉默PSMA基因表達(dá)后發(fā)現(xiàn)LNCaP細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，但是對細(xì)胞生長影響不大，初步發(fā)現(xiàn) PSMA在前列腺癌的侵襲中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用［4］。那么PSMA在前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中究竟起著什么樣的作用，又是通過什么樣的途徑來進(jìn)行調(diào)控的呢?通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，在PSMA基因的表達(dá)顯著下調(diào)后，有CDH6、CXCL12、IL－18、IL8RB、IGF1、MMP13、MMP3、MTSS1、TSHR 和ITGA7 10個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào);而CCL7、ITGB3、MDM2和MMP2 4個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)，其中尤以MDM2下調(diào)最為明顯。MDM2為細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控蛋白在前列腺癌中高表達(dá)，和前列腺癌惡性程度以及存活率相關(guān)。MDM2和P53結(jié)合，通過泛素化降解P53蛋白，維持細(xì)胞中P53蛋白的量的平衡。但是前列腺癌中MDM2基因的高表達(dá)打破這種平衡，導(dǎo)致抑癌蛋白P53過度降解，促進(jìn)了癌癥的發(fā)生并和其侵襲能力有關(guān)［13］。推測PSMA可能參與調(diào)控MDM2的表達(dá)，前列腺癌細(xì)胞中PSMA的高表達(dá)和MDM2的高表達(dá)存在相關(guān)性。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜連續(xù)的過程，包括瘤細(xì)胞的脫落，侵襲和遷移、黏附、局部生長等，這一過程涉及許多復(fù)雜因素，在腫瘤的進(jìn)展過程中調(diào)控這些過程基因的表達(dá)也在相應(yīng)變化著影響其進(jìn)展，使腫瘤向周圍侵襲轉(zhuǎn)移。目前報(bào)道的與腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控有關(guān)的基因有很多種，在這些基因共同作用下促進(jìn)腫瘤不同進(jìn)程的發(fā)生。因此，需要系統(tǒng)地分析這些基因才能闡明腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制?；蛐酒夹g(shù)具有高通量的特點(diǎn)，可以同時(shí)檢測大量基因，進(jìn)行平行分析，并且還具有快速、準(zhǔn)確、敏感等特點(diǎn)，顯示了分析疾病相關(guān)基因方面的優(yōu)越性。

本研究通過腫瘤轉(zhuǎn)移基因芯片對84個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在下調(diào)PSMA基因表達(dá)后，CDH6、CXCL12等10個(gè)基因發(fā)生顯著上調(diào)，而CCL7、MDM2等4個(gè)基因發(fā)生顯著下調(diào)，研究結(jié)果將為更深入地研究PSMA的功能及調(diào)控途徑奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。這些表達(dá)差異的基因在前列腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生及進(jìn)展過程中所起的作用及相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。我們將構(gòu)建PSMA基因亞克隆以及LNCaP細(xì)胞cDNA文庫，通過酵母雙雜交技術(shù)從蛋白水平篩選PSMA相互作用蛋白，進(jìn)一步揭示PSMA的功能以及在前列腺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制。

表3 PSMA在RNAi沉默條件下腫瘤轉(zhuǎn)移芯片分析Table 3.Fold of up－ or down－regulation after treatment with RNAi targeting PSMA

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