李 瀅， 李 娟， 黃蓓暉， 劉俊茹， 鄭 冬

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，廣東廣州510080)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性克隆性漿細(xì)胞過度增殖的血液系統(tǒng)腫瘤，至今尚不能被治愈［1］。目前MM治療的一線方案包括含新藥(如硼替佐米、沙利度胺)的聯(lián)合方案及傳統(tǒng)方案(長(zhǎng)春新堿、吡柔比星、地塞米松聯(lián)合或不聯(lián)合地塞米松方案，即VADM或DVD方案)。含硼替佐米為主的聯(lián)合方案(硼替佐米、地塞米松聯(lián)合或不聯(lián)合脂質(zhì)體阿霉素，即PAD或VD方案，簡(jiǎn)稱硼替佐米聯(lián)合方案)化療起效快、療效確切、骨髓毒副作用少，是現(xiàn)今MM較為理想的治療方案［2］。研究表明，硼替佐米通過抑制細(xì)胞內(nèi) IκB因子降解，阻斷NF－κB活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖［2－3］。但機(jī)體正常免疫細(xì)胞如T細(xì)胞也需經(jīng)NF－κB通路進(jìn)行活化增殖［4］，因此，硼替佐米在抗腫瘤同時(shí)可能影響機(jī)體免疫功能。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cells，Treg細(xì)胞)是T細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群，具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，在腫瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病中起重要作用［4］。目前認(rèn)為Treg細(xì)胞與MM的腫瘤負(fù)荷、疾病生存期有密切關(guān)系［5－7］，而具有抗 MM 增殖作用的多種藥物如沙利度胺、環(huán)磷酰胺等對(duì)患者Treg細(xì)胞有抑制作用［7－8］。但新藥硼替佐米對(duì)MM患者Treg細(xì)胞的影響目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)化療前后初治MM患者外周血Treg細(xì)胞水平，并對(duì)比接受硼替佐米聯(lián)合方案及傳統(tǒng)方案化療的初治MM患者化療后Treg細(xì)胞變化及與腫瘤負(fù)荷、療效的關(guān)系，以了解MM腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制及硼替佐米對(duì)Treg細(xì)胞的影響，為MM的腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 研究對(duì)象

選取2010年7月～2011年8月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科收治的42例初治MM患者。MM診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效評(píng)價(jià)依據(jù)國(guó)外MM診斷及療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［9］。42例中男25例，女17例，中位年齡56歲(33～75歲)。根據(jù)Durie－Salmon分期(D－S分期):II期7例，III期35例;國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分期(International Standard Staging，ISS分期):1期21例，2期6例，3期15例;根據(jù)疾病免疫學(xué)分型:IgG型19例，IgA型9例，輕鏈型10例，IgD型4例。其中30例接受硼替佐米聯(lián)合方案化療，12例接受傳統(tǒng)方案化療，見表1。

2 主要試劑及儀器

患者外周血單個(gè)核細(xì)胞使用人淋巴細(xì)胞分離液(TBD)及PBS(HyClone)分離洗滌。流式單抗(CD4－FITC、CD25－APC、FOXP3－PE)、APC、PE 同型對(duì)照、破膜劑、洗滌液均購(gòu)自Ebioscience。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)采用BD FASCanto流式細(xì)胞儀。

表1 42例初治MM患者臨床資料Table 1.Clinical characteristics in 42 cases of the newly－diagnosed MM patients

3 方法

3.1 標(biāo)本采集及細(xì)胞分離 所有觀察對(duì)象均于化療前1 d及第2療程化療前1 d的清晨空腹時(shí)抽取肘靜脈血，分別用肝素和EDTA抗凝后，用于進(jìn)行血清免疫球蛋白分析、血清β2－微球蛋白(β2－microglobulin，β2－MG)檢測(cè)及全血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。使用人淋巴細(xì)胞分離液分離肝素抗凝外周血單個(gè)核細(xì)胞，使用PBS重懸至2×109/L。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞 取2支試管各加入100 μL上述細(xì)胞懸液，分別加入20 μL CD4－FITC、CD25－APC及CD4－FITC、APC同型對(duì)照單克隆流式抗體，充分混勻后4℃避光孵育30 min。每管加入2 mL洗滌劑混勻，300×g離心5 min，棄上清后重懸細(xì)胞。加入1 mL破膜劑混勻后4℃避光孵育45 min。加入2 mL洗滌劑再次洗滌后重懸細(xì)胞于100 μL PBS中，分別加入20 μL FOXP3－PE單抗及PE同型對(duì)照，混勻后4℃避光孵育30 min，洗滌后重懸細(xì)胞于500 μL洗滌劑中，上機(jī)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞比例。

3.3 數(shù)據(jù)分析 使用FCS Express V3軟件分析數(shù)據(jù)。使用SSC－FITC設(shè)門選出CD4+T淋巴細(xì)胞，參照APC同型對(duì)照在CD4+T細(xì)胞中圈出CD4+CD25+T細(xì)胞，再參照 PE同型對(duì)照設(shè)門 CD4+CD25+FOXP3+的Treg細(xì)胞，見圖1，結(jié)合同步淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)得出Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)。

Figure 1.Gating process of Treg cells.A:selecting CD4+T cells in FITC and SSC channels;B:gating CD25+cells in CD4+T cells on the basis of APC isotype.C:gating FOXP3+Treg cells in CD4+CD25+cells on the basis of PE isotype.圖1 Treg細(xì)胞設(shè)門過程

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)以中位數(shù)(范圍)表示，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析不同分組間Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)差異。對(duì)于非正態(tài)分布變量的相關(guān)性進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 臨床指標(biāo)與Treg細(xì)胞

根據(jù)MM患者D－S分期、ISS分期、是否合并貧血、高鈣血癥、低白蛋白血癥、腎功能損害及血清β2－MG＞5 500 μg/L對(duì)42例MM患者進(jìn)行分組分析，發(fā)現(xiàn)ISS 1期患者外周血Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)為0.09×109/L，低于ISS 2、3期患者的外周血Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)0.18×109/L(P ＜0.05)，見圖 2;血清 β2－ MG ＞5 500 μg/L患者 Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)為 0.18 ×109/L，高于血清β2－MG≤5 500 μg/L患者的 Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)0.10×109/L(P＜0.05)。而不同D－S分期、是否合并貧血、高鈣血癥、低白蛋白血癥及腎功能損害分組的MM患者Treg細(xì)胞對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Figure 2.Treg cells of different ISS stages in MM patients detected by FCM.A:Treg cells in a patient of ISS stage 1;B:Treg cells in a patient of ISS stage 2;C:Treg cells in a patient of ISS stage 3.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同ISS分期MM患者Treg細(xì)胞

2 化療、化療療效、血清β2－MG與Treg細(xì)胞的關(guān)系

對(duì)42例MM患者于化療前和化療后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞并進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)化療后患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)較化療前下降，從化療前0.13×109/L降至化療后0.10×109/L(P ＜0.01)。

根據(jù)MM患者化療后M蛋白下降是否超過25%將患者分為緩解組及未緩解組，發(fā)現(xiàn)緩解組的31例患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降(P＜0.01)，而未緩解組的11例患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

化療后8例患者血清β2－MG水平較化療前下降＞50%，而34例患者血清β2－MG雖有改變，但下降≤50%，據(jù)此將患者分為β2－MG下降＞50%組及β2－MG下降≤50%組。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)2組患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)均下降，β2－MG下降＞50%的MM患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)從0.19×109/L降至0.08×109/L(P ＜0.01)，而 β2－MG 下降≤50%組從 0.12×109/L下降至0.10×109/L(P ＜0.01)，β2－MG 下降＞50%的MM患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降幅度大，2組Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降值對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，見表 4。

表2 不同臨床指標(biāo)分組Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)比較Table 2.Treg cell count comparison among different clinicalcharacteristics groups［×109/L.median(range)］

表3 不同化療療效組的Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 3.Treg cell count in different chemoresponse groups［×109/L.median(range)］

表4 化療后不同β2－MG下降組的Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 4.Treg cell count in different β2 － MG reduction groups after chemotherapy［×109/L.median(range)］

3 不同化療方案對(duì)Treg細(xì)胞改變影響

根據(jù)不同化療方案對(duì)MM患者進(jìn)行分組分析，發(fā)現(xiàn)無論在接受硼替佐米聯(lián)合化療方案的30例患者或接受傳統(tǒng)方案化療的12例患者中，化療后MM患者外周血Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)均較化療前下降，接受硼替佐米聯(lián)合方案患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)從化療前0.17×109/L降至化療后0.10×109/L，而接受傳統(tǒng)方案患者從Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)從化療前0.10×109/L降至化療后0.08×109/L，2組Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)變化對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)，見圖3、表5。

Figure 3.Treg cell count changes in different chemotherapy groups detected by FCM.A:Treg cells of patient A before bortezomibbased treatment;B:Treg cells of patient A after bortezomib－based treatment;C:Treg cells of patient B before conventioal treatment;D:Treg cells of patient B after conventional treatment.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)接受硼替佐米聯(lián)合方案及傳統(tǒng)方案化療前后Treg細(xì)胞改變

表5 不同方案化療前后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 5.Treg cell count before and after different chemotherapies［×109/L.median(range)］

接受硼替佐米聯(lián)合化療的30例患者中，獲得緩解的21例患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)從0.17×109/L降至0.08×109/L(P ＜0.01)，而未獲得緩解的9例患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。接受傳統(tǒng)方案未獲緩解的10例患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)未較化療前下降(P＞0.05)，接受傳統(tǒng)方案獲緩解患者因例數(shù)過少(2例)未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，見表6。

表6 不同化療療效治療前后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 6.Treg cell count before and after different chemoresponses［×109/L.median(range)］

接受硼替佐米聯(lián)合化療的30例患者中，8例患者化療后血清β2－MG下降＞50%，22例患者β2－MG下降≤50%。分析發(fā)現(xiàn)β2－MG下降＞50%的患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，從化療前0.19×109/L降至化療后0.08×109/L(P ＜0.01)，而 β2－MG下降≤50%患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)未較化療前下降(P＞0.05)，見表7。接受傳統(tǒng)方案化療后患者血清β2－MG下降均不超過50%，因此未進(jìn)行分組分析。對(duì)接受硼替佐米聯(lián)合化療方案的MM患者化療后 Treg計(jì)數(shù)改變與血清 β2－MG改變進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)接受硼替佐米方案化療患者外周血Treg計(jì)數(shù)下降與血清β2－MG下降水平呈線性相關(guān)(r=0.40，P ＜0.05)，見圖4。

表7 硼替佐米聯(lián)合化療患者不同β2－MG下降治療前后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 7.Treg cell count changes in different β2 － MG reduction groups before and after bortezomib－based treatment［×109/L.median(range)］

Figure 4.The relationship between changes of Treg cell count and serum β2 － MG in patients after bortezomib －based treatment.圖4 硼替佐米聯(lián)合化療后患者Treg細(xì)胞改變與血清β2－MG改變的相關(guān)關(guān)系

討 論

MM患者外周血Treg細(xì)胞與MM發(fā)病及預(yù)后有關(guān):初治的MM患者外周血Treg細(xì)胞增多，而在癌前病變階段及緩解期的患者Treg細(xì)胞與正常人相比無顯著差異［6］;Treg細(xì)胞增高的MM患者中位生存時(shí)間較短，復(fù)發(fā)率增大［4，8，10］。本研究證實(shí)處于疾病早期、腫瘤負(fù)荷較小的MM患者Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)較低，化療后獲緩解患者Treg細(xì)胞下降，提示MM患者外周血Treg細(xì)胞與腫瘤負(fù)荷及療效有關(guān)，推測(cè)Treg增高所致的機(jī)體免疫功能下調(diào)可能為MM實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的重要機(jī)制之一。

隨著造血干細(xì)胞移植術(shù)以及新藥如硼替佐米、雷利度胺的應(yīng)用，MM患者的治療緩解率及生存時(shí)間得到了明顯提高［3］，但腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)仍是MM治療的一大困境［10］。如何抑制Treg細(xì)胞活化、增殖，提高免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫，是目前克服骨髓瘤耐藥及復(fù)發(fā)的重要手段之一［11］。應(yīng)用于MM治療的藥物如環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱、沙利度胺、雷利度胺等均被證實(shí)具有清除MM患者Treg細(xì)胞作用［7－8，12－13］，但尚未見關(guān)于硼替佐米對(duì) MM 患者Treg細(xì)胞影響的研究。硼替佐米可通過抑制NF－κB通路抑制T細(xì)胞增殖、活化，應(yīng)用該藥治療移植物抗宿主疾病的實(shí)驗(yàn)證實(shí)硼替佐米對(duì)人體外周血Treg細(xì)胞有抑制、清除作用［14］。體外研究發(fā)現(xiàn)該藥以誘導(dǎo)未成熟的Treg細(xì)胞凋亡作用為主，對(duì)已成熟的Treg細(xì)胞無殺傷作用［15］。而本研究首次發(fā)現(xiàn)對(duì)比傳統(tǒng)方案，接受硼替佐米化療的MM患者化療后Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)下降更明顯，提示硼替佐米對(duì)MM患者的Treg細(xì)胞具有抑制作用，考慮對(duì)Treg細(xì)胞的抑制可能是硼替佐米發(fā)揮抗腫瘤作用的重要環(huán)節(jié)之一。硼替佐米可能通過解除機(jī)體免疫抑制的微環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞免疫的抗腫瘤能力，重建細(xì)胞免疫間的平衡穩(wěn)態(tài)而達(dá)到良好的清除腫瘤功能。

研究亦發(fā)現(xiàn)在接受硼替佐米聯(lián)合方案化療的初治MM患者中，Treg細(xì)胞下降與腫瘤負(fù)荷的減少及治療反應(yīng)有關(guān)，提示硼替佐米對(duì)于原發(fā)耐藥患者外周血Treg細(xì)胞的清除作用較少，患者化療療效不佳可能與藥物對(duì)Treg細(xì)胞清除不足有關(guān)，推測(cè)聯(lián)合Treg細(xì)胞抑制劑及硼替佐米的化療可在目前治療基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高M(jìn)M患者療效。本研究為MM尋找新的治療方案奠定了理論基礎(chǔ)，抑制Treg細(xì)胞的增殖與功能、增強(qiáng)免疫細(xì)胞特異性抗腫瘤免疫可能將進(jìn)一步提高硼替佐米治療MM的療效。

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