黃 莉 黃純蘭

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)威靈仙中的有效成分三萜皂苷［1］可以通過(guò)誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡達(dá)到抗腫瘤作用［2-3］，筆者在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷對(duì)NB4細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用［4］，但是對(duì)NB4細(xì)胞是否具有誘導(dǎo)分化作用尚無(wú)研究。因此，本研究擬從細(xì)胞的增殖抑制、形態(tài)變化和功能抗原表達(dá)等方面研究威靈仙總皂苷對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞是否具有誘導(dǎo)分化作用，以期為進(jìn)一步研究威靈仙在血液系統(tǒng)惡性腫瘤臨床治療上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 威靈仙總皂苷由瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院參照文獻(xiàn)［5-7］提取，系棕色粉末狀結(jié)晶，儲(chǔ)存液 （16 mg/mL）用無(wú)血清RPMI1640（Gibeo公司產(chǎn)品）溶解，應(yīng)用液用含10%小牛血清的RPMI配制；佛波醇酯（TPA）、硝基藍(lán)四氮唑（NBT）、全反式維甲酸（ATRA）干粉為美國(guó)Sigma產(chǎn)品；CD11b和CD33購(gòu)自BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) NB4細(xì)胞株由四川大學(xué)華西醫(yī)院干細(xì)胞生物研究室饋贈(zèng)。將NB4細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清、青霉素100 IU/mL及鏈霉素100 μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的孵箱中懸浮培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，臺(tái)盼藍(lán)染色拒染率在95%以上的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖率和形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞，以1×105/mL細(xì)胞密度分別接種于含5種不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷（分別為 25、50、100、200、400 μg/mL）的培養(yǎng)液中，并設(shè)不加藥空白對(duì)照組和1 μmol/L ATRA陽(yáng)性對(duì)照組，培養(yǎng)體系8 mL，連續(xù)培養(yǎng)5 d。每日取各組細(xì)胞，記數(shù)活細(xì)胞，繪制生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算第5日的生長(zhǎng)抑制率。隔日取各濃度組細(xì)胞，離心涂片瑞氏染色后油鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞形態(tài)變化并計(jì)算細(xì)胞誘導(dǎo)分化率，誘導(dǎo)分化率（%）=（200-早幼粒細(xì)胞）/200×100%。

1.4 硝基藍(lán)四氮唑 （NBT）還原實(shí)驗(yàn) 取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液500 μL，與1 g/L的NBT溶液混合，加入200 μg/mL TPA溶液100 μL，37℃孵育30 min后離心涂片，光鏡下見(jiàn)胞漿內(nèi)含藍(lán)黑色顆粒的為陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，得出NBT陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 透射電鏡觀察 收集第4日各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，離心，PBS洗滌，戊二醛固定，按常規(guī)制備超薄切片，在透射電鏡下觀察細(xì)胞核、染色質(zhì)等的變化并照相。

1.6 細(xì)胞分化表面抗原CD11b和CD33的檢測(cè) 取經(jīng)威靈仙總皂苷作用后的細(xì)胞，用CD11b和CD33單抗對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)（平均熒光強(qiáng)度）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（表示，各組應(yīng)用方差分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以a＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 威靈仙總皂苷對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用NB4細(xì)胞后，隨著劑量增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖明顯受抑，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的量效關(guān)系。在96 h時(shí)出現(xiàn)抑制率的最高值。但在120 h，威靈仙總皂苷各組受抑率整體出現(xiàn)輕度下降。400 μg/mL組的抑制率變化幅度在各組中最大，96 h生長(zhǎng)抑制率達(dá)到（37.41±2.16）%，與陽(yáng)性對(duì)照組比較沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率（%，

表1 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率（%，

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2.2 威靈仙總皂苷對(duì)NB4細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞分化率的影響與空白對(duì)照組相比，威靈仙總皂苷組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)典型分化作用，僅個(gè)別細(xì)胞核出現(xiàn)腎形或桿核。卻出現(xiàn)了明顯的核固縮、核邊聚、核碎裂、胞膜出泡現(xiàn)象，并可見(jiàn)典型的凋亡小體。隨濃度增高，時(shí)間延長(zhǎng)，該現(xiàn)象越明顯。而陽(yáng)性對(duì)照組，細(xì)胞體積變小，胞漿增多，核縮小，核漿比例減少，細(xì)胞核由圓、橢圓轉(zhuǎn)變?yōu)槟I形、桿狀，甚至出現(xiàn)分葉。見(jiàn)圖1，表2。

表2 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用96 h后對(duì)NB4細(xì)胞分化和形態(tài)的影響

表2 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用96 h后對(duì)NB4細(xì)胞分化和形態(tài)的影響

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

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圖1 威靈仙總皂苷400 μg/mL組72 h后NB4細(xì)胞形態(tài)（Wright's-Giemsa染色，×1000）

2.3 NBT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果 威靈仙總皂苷各濃度組作用于NB4細(xì)胞5 d后，NBT還原法檢測(cè)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)濃度組細(xì)胞內(nèi)無(wú)或者僅有少量的藍(lán)色顆粒，隨濃度和時(shí)間的變化，NBT陽(yáng)性率無(wú)明顯增加，與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷對(duì)NB4細(xì)胞NBT還原率的影響

表3 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷對(duì)NB4細(xì)胞NBT還原率的影響

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2.4 透射電鏡 與Wright's-Giemsa染色的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變類似，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)威靈仙總皂苷作用96 h后，在透射電鏡下并未發(fā)現(xiàn)有較明顯的胞漿、胞核成熟現(xiàn)象，僅個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)桿核或者腎形核改變。但是觀察到NB4細(xì)胞明顯呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)變化：胞膜皺縮、染色質(zhì)凝聚并邊集呈月牙狀改變，核仁消失。見(jiàn)圖2。

圖2 威靈仙總皂苷400 μg/mL作用96 h后NB4細(xì)胞電鏡圖

2.5 細(xì)胞表面分化抗原CD11b、CD33的檢測(cè) 1 μmol/L ATRA作用NB4細(xì)胞后，可明顯使CD11b表達(dá)增加（P＜0.01），CD33表達(dá)下降。而威靈仙總皂苷各劑量組CD11b表達(dá)的陽(yáng)性率低，CD33表達(dá)無(wú)明顯下降，與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。 見(jiàn)圖 3，表 4。

表4 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用于NB4細(xì)胞72 h 后CD11b、CD33 表達(dá)（n=3

表4 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用于NB4細(xì)胞72 h 后CD11b、CD33 表達(dá)（n=3

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圖3 不同劑量威靈仙總皂苷作用NB4細(xì)胞72h后CD11b、CD33的表達(dá)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷對(duì)NB4細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，隨著作用質(zhì)量濃度增大、作用時(shí)間增長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率明顯降低，抑制率明顯增高，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的量效關(guān)系。該結(jié)果與我們前期報(bào)道一致，與文獻(xiàn)報(bào)道亦相符合［4］。在120 h所有實(shí)驗(yàn)組的抑制率出現(xiàn)整體輕度下降，根據(jù)120 h陰性對(duì)照組臺(tái)盼藍(lán)拒染率的明顯下降，分析可能與在實(shí)驗(yàn)后期細(xì)胞死亡率增加有關(guān)。

NB4細(xì)胞在被誘導(dǎo)向正常細(xì)胞方向分化成熟過(guò)程中，逐漸獲得吞噬能力，細(xì)胞糖代謝活躍。在TPA的激發(fā)下，細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生增多，中間代謝產(chǎn)物大量脫氫，所脫的氫能將無(wú)色染料NBT還原沉淀于胞質(zhì)內(nèi)，呈現(xiàn)藍(lán)黑色顆粒沉著于細(xì)胞內(nèi)有酶活性的部位，顯微鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞有著色斑。這種細(xì)胞即為NBT還原陽(yáng)性細(xì)胞，是細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的威靈仙總皂苷作用NB4細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)無(wú)或者僅有少量的藍(lán)色顆粒，但數(shù)量明顯低于維甲酸誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組，隨著威靈仙總皂苷劑量的增加，NBT陽(yáng)性率無(wú)明顯增加，由此提示威靈仙總皂苷誘導(dǎo)分化作用不明顯。同樣，在透射電鏡檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，威靈仙總皂苷組干預(yù)后細(xì)胞并未出現(xiàn)較明顯的胞漿、胞核成熟現(xiàn)象，但是卻觀察到NB4細(xì)胞呈現(xiàn)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝聚并邊集呈月牙狀改變，核仁消失等凋亡形態(tài)學(xué)變化。然而，在誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞形態(tài)改變不一定典型，而且一些早期前體細(xì)胞缺乏形態(tài)學(xué)和生物學(xué)的特征，因而單憑形態(tài)學(xué)判斷有一定的困難?，F(xiàn)已知，隨著白血病細(xì)胞分化，細(xì)胞膜表面某些蛋白抗原也相應(yīng)發(fā)生改變，根據(jù)抗原表達(dá)可較精確地判斷試驗(yàn)細(xì)胞所處的分化階段。CD33抗原是早期粒細(xì)胞的標(biāo)志，90%AML患者的白血病細(xì)胞表達(dá)CD33抗原，其表達(dá)降低可作為細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志之一。CD11b抗原是細(xì)胞成熟分化的另一標(biāo)志，早幼及早中幼粒細(xì)胞表面不表達(dá)CD11b，而隨著細(xì)胞分化成熟為各期粒細(xì)胞以及成熟單核細(xì)胞，CD11b表達(dá)陽(yáng)性率逐漸升高［8］，近年來(lái)已經(jīng)把CD11b作為髓系白血病分化的重要標(biāo)志。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種抗原的表達(dá)，其結(jié)果與鏡下觀測(cè)一致，NB4細(xì)胞經(jīng)各劑量威靈仙總皂苷處理后，細(xì)胞表面的CD33未隨時(shí)間和濃度的變化出現(xiàn)下降趨勢(shì)，而CD11b也未隨著時(shí)間和劑量的變化而表達(dá)增加。CD33、CD11b的表達(dá)與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，而ARTA組可以顯著提高NB4細(xì)胞CD11b的表達(dá)并誘導(dǎo)CD33抗原表達(dá)降低。流式法檢測(cè)兩種抗原表達(dá)結(jié)果與鏡下觀測(cè)一致。因此，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)以及前期觀察，威靈仙總皂苷各質(zhì)量濃度組對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞無(wú)明顯的誘導(dǎo)分化作用。產(chǎn)生明顯的增殖抑制作用的原因可能系誘導(dǎo)NB4發(fā)生凋亡為主。至于威靈仙總皂苷如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及發(fā)生凋亡的機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。

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