馬小茗，林培容，陳陟陽，鞠振宇

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021；2.北京華信醫(yī)院，北京 100016）

Gadd45（Growth arrest and DNA damage inducible gene Gadd45）家族包括3個成員：Gadd45α （Gadd45α/Gadd45）、Gadd45b（Gadd45β/ MyD118）、Gadd45g（Gadd45γ/CR6），它們在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等方面起到重要的作用［1-3］。Gadd45α是Gadd45基因家族中唯一的p53靶基因［4］，它在細(xì)胞的生命過程中起到重要的作用，其中包括遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的維持［5］、細(xì)胞周期的調(diào)控［6］、核苷酸剪切修復(fù)［7，8］以及凋亡調(diào)控［9，10］等。研究認(rèn)為，Gadd45基因家族在生理或環(huán)境的壓力作用下誘導(dǎo)快速表達(dá)，引起細(xì)胞周期抑制、DNA修復(fù)、細(xì)胞存活或凋亡。Gadd45作為壓力刺激敏感的基因，其功能主要是與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的重要蛋白、分子等相互作用［11］。

造血細(xì)胞包括造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞，對放射線照射非常敏感。5～10Gy的放射線照射劑量很可能導(dǎo)致小鼠造血系統(tǒng)破壞從而導(dǎo)致死亡［12］。已知Gadd45α作為壓力刺激敏感反應(yīng)基因，唯一的Gadd45家族中p53下游的靶基因，而p53作為應(yīng)激反應(yīng)的重要信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、DNA修復(fù)以及凋亡，從而研究Gadd45α基因敲除小鼠造血干細(xì)胞的功能意義重大。

1 材料和方法

1.1 動物及設(shè)備

本實驗所用的小鼠：Gadd45α-/-（來自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心）小鼠（遺傳背景：C57BL/ 6J）12周齡；野生型小鼠采用同窩對照小鼠C57BL/ 6J（來自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心）12周齡。動物許可證號SCXK（京）2009-0007。

設(shè)備為：美國BD公司Aria流式細(xì)胞儀； Olympus熒光顯微鏡；Them ro水套式細(xì)胞培養(yǎng)箱；超凈工作臺等。

1.2 方法

1.2.1 PCR方法鑒定Gadd45a-/-小鼠基因型

小鼠在出生10 d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，裂解組織提取基因組DNA，PCR鑒定基因型，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 m in；變性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，35個循環(huán)；72℃延伸3 m in。鑒定引物為Gadd45a w t：5＇-cct ctg ctt acc tct gca caa-3＇；Gadd45a cm：5＇-gaa gac cta gac agc acg gtt-3＇；Gadd45am t：5＇-aga acg aga tca gca gcc tct-3＇； Gadd45a-/-產(chǎn)物長度211 bp，WT產(chǎn)物長度324 bp，PCR試劑購自上海生工生物技術(shù)有限公司，中國。

1.2.2 骨髓干細(xì)胞體外克隆形成實驗

選用12周齡的Gadd45α-/-及C57BL/6J小鼠，常規(guī)制備骨髓細(xì)胞并進(jìn)行骨髓長期造血干細(xì)胞表面熒光標(biāo)記，使用流式細(xì)胞儀（MACS富集后）分選表面標(biāo)記為Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-的單個造血干細(xì)胞與U型底96孔板中。將其進(jìn)行鈷60來源的放射線照射（irradiation，IR），劑量為2Gy。照射后在96孔板中進(jìn)行單個干細(xì)胞的培養(yǎng)，14d時記錄克隆的數(shù)目和大小，比較長期造血干細(xì)胞的數(shù)量和自我更新能力。

1.2.3 競爭性骨髓移植實驗

受體小鼠（CD45.1）經(jīng)過60Co全身照射，劑量率0.5～1 Gy/min，總劑量9 Gy；供體小鼠、競爭者小鼠（CD45.1/2）處死取股/脛骨，研磨制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至2×107/m L，供體與競爭者骨髓細(xì)胞比例按1∶1，將每組供體骨髓細(xì)胞與競爭者骨髓細(xì)胞混勻，通過眼后靜脈叢或鼠尾靜脈注射，每只受體小鼠接受注射液體總量控制在200～300μL，含單個核骨髓細(xì)胞約1×106個。

移植后受體均給予抗生素一周（飲水中添加乳酸左氧氟沙星0.5 mg/m L）。

移植后注意飲食飲水補(bǔ)給，以提高移植成活率。

1.2.4 放射線照射全骨髓移植受體小鼠—生存曲線實驗

受體小鼠C57BL/6J經(jīng)過60Co全身照射，劑量率0.5～1 Gy/min，總劑量9 Gy；供體小鼠Gadd45α-/-及同窩對照C57BL/6J，分別取全骨髓細(xì)胞1×106于250μL無菌PBS中，經(jīng)眼后注射至新的受體小鼠。移植3個月造血重建穩(wěn)定后，給予8.5Gy的60Co照射，觀察其存活情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定結(jié)果

剪取10d的小鼠腳趾，以飽和氯化鈉法提取小鼠基因組DNA，進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，野生型產(chǎn)物長度為324 bp，Gadd45a缺失產(chǎn)物長度211 bp。

圖1 PCR鑒定Gadd45a基因敲除小鼠的凝膠電泳分析Fig.1 PCR genotyping of the Gadd45a kockoutmice注：Marker為DL2000 marker，H 2 0為空白對照，WT為（C57BL/6J）野生型對照，KO為（Gadd45α-/-）基因敲除對照Note：Themarker is the DNA molecular weightmarker；H2 O indicates the negative control；WT：wild-type control；KO：Gadd45a gene knockout control

2.2 骨髓干細(xì)胞體外克隆實驗結(jié)果

長期造血干細(xì)胞（long-term hematopoietic stem cells，LT-HSC）具有自我更新及多向分化能力，單克隆培養(yǎng)能夠很好的反應(yīng)其功能。應(yīng)用流式細(xì)胞儀將表面標(biāo)記為Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-的1個LT-HSC細(xì)胞分選至96孔板一孔中，在含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)14 d后觀察單克隆形成情況。結(jié)果如圖2所示，圖2A分別為C57BL/6J的LT-HSC克隆，Gadd45α-/-的LT-HSC克隆，IR后C57BL/6J的LT-HSC克隆，IR后Gadd45α-/-的LT-HSC克隆。結(jié)果顯示，Gadd45α-/-的LT-HSC與C57BL/6J的相比有顯著的抗放射能力。統(tǒng)計結(jié)果圖2B所示，IR后C57BL/6J的LT-HSC無克隆形成，而Gadd45α-/-的LT-HSC仍能形成大克隆，有明顯的抗放射能力。

圖2 長期造血干細(xì)胞體外克隆結(jié)果Fig.2 The Resultsof LT-HSC clone form ing in vitro注：A為WT LT：C57BL/6J小鼠的Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-克隆結(jié)果；KO LT：Gadd45α-/-小鼠的Lineage-Sca1+ckit+ CD34-Flt3-克隆結(jié)果；IR WT LT：2Gy放射線照射后，C57BL/6J小鼠的Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-克隆結(jié)果；IR KO LT：2Gy放射線照射后，Gadd45α-/-小鼠的Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-克隆結(jié)果；B為C57BL/6J、Gadd45α-/-以及放射線照射后C57BL/6J、Gadd45α-/-LT-HSC克隆形成統(tǒng)計結(jié)果Note：A WT LT：The Results ofC57BL/6Jmice Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-clone forming；KO LT：The Resultsof Gadd45α-/-mice Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-clone forming；IR WT LT：After 2Gy irradiation，the Results of C57BL/6Jmice Lineage-Sca1+ ckit+CD34-Flt3-clone forming；IR KO LT：After 2Gy irradiation，the Results of Gadd45α-/-mice Lineage-Sca1+ckit+CD34-Flt3-clone forming；B：The statistical Results of C57BL/6J、Gadd45α-/-and post-irradiation LT-HSC clone forming

2.3 競爭性骨髓移植實驗

競爭性骨髓移植是評價造血干細(xì)胞自我更新能力的標(biāo)準(zhǔn)試驗。放射性照射摧毀受體小鼠自身免疫系統(tǒng)，并使自身干細(xì)胞從龕中移除易于外源供體的植入。供體來源的骨髓造血干細(xì)胞在造血重建的過程中，移植后1個月時，對外周血細(xì)胞的貢獻(xiàn)在主要來自于短期骨髓干細(xì)胞的造血及分化能力，在3個月后則來自于長期干細(xì)胞的造血及分化能力。如圖3所示，競爭性骨髓移植觀察造血干細(xì)胞功能，Gadd45α基因敲除小鼠的長期造血干細(xì)胞與C57BL/6J的相比在一次競爭性骨髓移植3個月內(nèi)并無顯著差異。

2.4 放射線照射全骨髓移植受體小鼠—生存曲線實驗

圖3 競爭性骨髓移植結(jié)果Fig.3 The Results of competitive transplantation注：A競爭性骨髓移植一個月外周血嵌合率；B競爭性骨髓移植二個月外周血嵌合率；C競爭性骨髓移植3個月骨髓嵌合率Note：A：The chimerism of competitive bonemarrow transplantation in peripheral blood after the firstmonth；B：The chimerism of competitive bone marrow transplantation in peripheral blood after the second month；C：The chimerism of competitive bone marrow transplantation in bone marrow after the third month

Gadd45α作為壓力刺激敏感反應(yīng)基因，在各種生理或環(huán)境的壓力作用下誘導(dǎo)快速表達(dá)，低劑量的放射線照射長期造血干細(xì)胞觀察，Gadd45α基因缺失長期造血干細(xì)胞有抵抗低劑量放射線照射的能力；而在連續(xù)移植的壓力下，Gadd45α基因缺失的長期造血干細(xì)胞能力又遠(yuǎn)遠(yuǎn)下降。放射線照射是臨床放療的治療手段，Gadd45α基因是否能抵抗放射線對造血干細(xì)胞功能的影響意義重大。8.5 Gy的放射線照射全骨髓移植后3個月的受體小鼠，觀察其生存情況，結(jié)果如圖4所示，8.5 Gy的放射線損傷，Gadd45α-/-與C57BL/6J全骨髓移植后的受體小鼠存活情況無顯著差異。

圖4 8.5 Gy放射線照射后生存曲線Fig.4 Survival curves after 8.5 Gy irradiation注：Gadd45α-/-與C57BL/6J分別為供體全骨髓移植受體小鼠3個月后，8.5 Gy放射線照射受體，紅色代表Gadd45α-/-移植的受體小鼠生存情況，黑色代表C57BL/6J移植的受體小鼠生存情況Note：Gadd45α-/-and C57BL/6J transp lant recipient mice.A fter 3 months，8.5 Gy irradiation receptors，red represents the survival of Gadd45α-/-mice，black represents the survival of C57BL/6J recipientmice

3 討論

已有研究證明，Gadd45a作為p53下游靶基因，參與眾多細(xì)胞信號通路的調(diào)控，對細(xì)胞周期、凋亡等過程中起重要的作用。研究報導(dǎo)，紫外照射刺激下，Gadd45a通過Gadd45a-p38-NF-kB信號通路促進(jìn)細(xì)胞存活［13］。Gadd45a基因敲除小鼠在紫外的刺激下，骨髓細(xì)胞凋亡增加，c IAP-1，Bcl-2，Bcl-xL等表達(dá)下降［14］。

Gadd45a基因在造血干祖細(xì)胞功能中作用鮮有研究，我們建立了Gadd45a基因單敲除小鼠，采用流式細(xì)胞儀分選骨髓造血干細(xì)胞，在2Gy的放射線刺激下，檢測造血干細(xì)胞的克隆形成能力，發(fā)現(xiàn)Gadd45a基因敲除與C57BL/6J相比更加抵抗低劑量輻射，維持造血干細(xì)胞功能。為了更進(jìn)一步了解Gadd45a基因敲除對造血干祖細(xì)胞功能的影響，進(jìn)行競爭性骨髓移植實驗，連續(xù)觀察3個月的結(jié)果顯示，Gadd45a基因敲除小鼠的造血干細(xì)胞功能與C57BL/6J小鼠的造血干細(xì)胞功能相比并無顯著差異。Gadd45a基因?qū)Ω鞣N生理或環(huán)境的壓力作用下都會被快速的誘導(dǎo)表達(dá)，高劑量放射線照射全骨髓移植3個月后的受體小鼠發(fā)現(xiàn)，Gadd45a基因的有無對高劑量的放射線損傷無顯著差異。

Gadd45作為壓力刺激敏感的基因，其功能主要是與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的重要蛋白、分子等相互作用。低劑量的放射損傷后，Gadd45a基因敲除小鼠的長期造血干細(xì)胞自我更新能力增強(qiáng)，而Gadd45a基因的有無對高劑量的放射線損傷反應(yīng)無顯著的差異。競爭性骨髓移植觀察Gadd45a基因敲除一次移植造血重建功能并無影響。在放射線損傷情況下，Gadd45a基因缺失短期內(nèi)可能激活p38信號通路促進(jìn)存活，而高劑量損傷中Gadd45a基因缺失沒有體現(xiàn)出差異。造血重建能力要通過連續(xù)移植長期觀察Gadd45a基因缺失是否對小鼠造血重建功能有影響，而在一次移植中并沒有顯現(xiàn)出來。我們推測短期的壓力作用下Gadd45a基因缺失造血干細(xì)胞DNA損傷修復(fù)加強(qiáng)，p38信號通路起主導(dǎo)作用，而長期來看DNA損傷累積，Gadd45a與其他信號分子等相互作用最終是體現(xiàn)功能的下降，有待于進(jìn)一步研究。Gadd45a基因缺失在放射線損傷后對于骨髓造血干細(xì)胞功能的影響，以及其他壓力下造血干細(xì)胞功能的影響有何不同有也待于進(jìn)一步研究。Gadd45a基因?qū)τ谥笇?dǎo)臨床治療中，如何防護(hù)對放化療病人造血功能的影響具有重要的意義。

［1］Fan，W.，Richter，G.，Cereseto，A.，Beadling，C.，and Smith，K.A.Cytokine response gene induces p21 and regulates both cell growth and arrest［J］.Oncogene1999，18：6573-6582.

［2］Abdel-Wahab，O.I.，Grubbs，E.，Viglianti，B.L.，Cheng，T.Y.，Ueno，T.，Ko，S.，Rabbani，Z.，Curtis，S.，Pruitt，S.K.，Dewhirst，M.W.，and Tyler，D.S.The role of hyperthermia in regional alkylating agent chemotherapy［J］.Clin Cancer Res2004，10：5919-5929.

［3］Vairapandi，M.，Balliet，A.G.，F(xiàn)ornace，A.J.，Jr.，Hoffman，B.，and Liebermann，D.A.The differentiation primary response gene MyD118，related to GADD45，encodes for a nuclear protein which interactswith PCNA and p21WAF1/CIP1［J］.Oncogene1996，12：2579-2594.

［4］Kastan，M.B.，Zhan，Q.，el-Deiry，W.S.，Carrier，F(xiàn).，Jacks，T.，Walsh，W.V.，Plunkett，B.S.，Vogelstein，B.，and Fornace，A.J.，Jr.A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxiatelangiectasia［J］.Cel1 1992，l 71：587-597.

［5］Hollander，M.C.，Sheikh，M.S.，Bulavin，D.V.，Lundgren，K.，Augeri-Henmueller，L.，Shehee，R.，Molinaro，T.A.，Kim，K.E.，Tolosa，E.，Ashwell，J.D.，Rosenberg，M.P.，Zhan，Q.，F(xiàn)ernandez-Salguero，P.M.，Morgan，W.F.，Deng，C.X.，and Fornace，A.J.，Jr.Genomic instability in Gadd45a-deficient mice［J］.Nat Genet1999，23：176-184.

［6］Zhan，Q.，Antinore，M.J.，Wang，X.W.，Carrier，F(xiàn).，Smith，M.L.，Harris，C.C.，and Fornace，A.J.，Jr.Association with Cdc2 and inhibition of Cdc2/Cyclin B1 kinase activity by the p53-regulated protein Gadd45［J］.Oncogene1999，18：2892-2900.

［7］Hollander，M.C.，Kovalsky，O.，Salvador，J.M.，Kim，K.E.，Patterson，A.D.，Haines，D.C.，and Fornace，A.J.，Jr.Dimethylbenzanthracene carcinogenesis in Gadd45a-nullmice is associated with decreased DNA repair and increased mutation frequency［J］.Cancer Res 2001，61：2487-2491.

［8］Smith，M.L.，F(xiàn)ord，J.M.，Hollander，M.C.，Bortnick，R.A.，Amundson，S.A.，Seo，Y.R.，Deng，C.X.，Hanawalt，P.C.，and Fornace，A.J.，Jr.p53-mediated DNA repair responses to UV radiation：studies of mouse cells lacking p53，p21，and/or gadd45 genes［J］.Mol Cell Biol 2000，20：3705 -3714.

［9］Harkin，D.P.，Bean，J.M.，Mik los，D.，Song，Y.H.，Truong，V.B.，Englert，C.，Christians，F(xiàn).C.，Ellisen，L.W.，Maheswaran，S.，Oliner，J.D.，and Haber，D.A.Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1［J］.Cell1999，97：575 -586.

［10］Takekawa，M.，and Saito，H.A family of stress-inducible GADD45-like proteinsmediate activation of the stress-responsive MTK1/MEKK4 MAPKKK［J］.Cell 1998，95：521-530.

［11］Hoffman，B.，and Liebermann，D.A.Gadd45 modulation of intrinsic and extrinsic stress responses in myeloid cells［J］.Cell Physiol 2009，218：26-31.

［12］Yu，H.，Shen，H.，Yuan，Y.，XuFeng，R.，Hu，X.，Garrison，S.P.，Zhang，L.，Yu，J.，Zambetti，G.P.，and Cheng，T.Deletion of Puma protects hematopoietic stem cells and confers long-term survival in response to high-dose gammairradiation［J］.Blood 2010，115：3472-3480.

［13］Gupta，M.，Gupta，S.K.，Hoffman，B.，and Liebermann，D.A.Gadd45a and Gadd45b protect hematopoietic cells from UV-induced apoptosis via distinct signaling pathways，including p38 activation and JNK inhibition［J］.Biol Chem2006，281：17552 -17558.

［14］Gupta，M.，Gupta，S.K.，Balliet，A.G.，Hollander，M.C.，F(xiàn)ornace，A.J.，Hoffman，B.，and Liebermann，D.A.Hematopoietic cells from Gadd45a-and Gadd45b-deficient mice are sensitized to genotoxic-stress-induced apoptosis［J］.Oncogene2005，24：7170-7179.