細(xì)胞角蛋白19和人乳腺球蛋白在乳腺癌陰性前哨淋巴結(jié)中的表達(dá)及臨床意義

左思 楊偉萍 韋長元 葉新青

乳腺癌是全身性疾病，其死亡主要原因是浸潤播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移的主要途徑為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。前哨淋巴結(jié)為區(qū)域淋巴引流中最先遭遇腫瘤細(xì)胞并最先發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一站淋巴結(jié)，其病理學(xué)結(jié)果能準(zhǔn)確預(yù)測腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)，但對(duì)于直徑＜2 mm的微小轉(zhuǎn)移灶常規(guī)病理HE染色難以檢出，致前哨淋巴結(jié)活檢(SLNB)結(jié)果假陰性而漏診。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化SP法檢測細(xì)胞角蛋白19(cytokerantin-19，CK19)和人乳腺球蛋白(human mammaglobin，hMAM)在乳腺癌陰性前哨淋巴結(jié)中的表達(dá)情況，討論兩者表達(dá)差異及與臨床病理因素的關(guān)系，為臨床提供治療依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009年2月至2010年2月臨床及病理資料齊全的60例乳腺癌患者，前哨淋巴結(jié)活檢均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的蠟塊為研究標(biāo)本?；颊呔鶠榕?，臨床檢查均無腋窩淋巴結(jié)腫大，年齡27～75歲，平均(50.38±11.24)歲，美藍(lán)染色法檢出35例，美藍(lán)染色聯(lián)合同位素示蹤法檢出25例。臨床TNM分期均為T1～T2 N0M0，其中T1期34例，T2期26例。外上象限26例，外下象限15例，內(nèi)上象限11例，內(nèi)下象限8例。病理類型浸潤性導(dǎo)管癌52例，浸潤性小葉癌5例，黏液腺癌3例。分子分型Luminal A型23例，Luminal B型13例，HER2過表達(dá)型15例，Basal-like型6例和正常乳腺樣型3例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療、化療或內(nèi)分泌治療。

1.2 CK19和hMAM檢測方法每個(gè)石蠟標(biāo)本連續(xù)切片3張，每張厚4 μm，切片間隔20～25 μm。采用免疫組化SP法，CK19、hMAM試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，每批染色用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 染色標(biāo)準(zhǔn)CK19表達(dá)于胞漿，每張乳腺癌前哨淋巴結(jié)切片胞漿中未出現(xiàn)棕黃色顆粒計(jì)為陰性，胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒計(jì)為陽性。hMAM表達(dá)于胞漿，陽性細(xì)胞數(shù)和染色程度乘積進(jìn)行評(píng)分劃分等級(jí)，染色強(qiáng)度評(píng)分0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細(xì)胞所占百分比＜25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分，兩者相乘0分為(-)，1～3分為(+)，4～6分為(++)，8～12分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。統(tǒng)計(jì)分析采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

60例乳腺癌陰性前哨淋巴結(jié)CK19和hMAM檢測結(jié)果，hMAM表達(dá)2例，陽性檢出率為3.3%。CK19除了hMAM陽性2例外，另外檢出6例，陽性檢出率為13.3%。hMAM表達(dá)2例，1例(+)，1例(++)，CK19表達(dá)8例。經(jīng)單因素分析，CK19表達(dá)與腫瘤T分期有關(guān)(P＜0.05)，與患者的年齡、月經(jīng)狀況、定位方法、腫瘤位置、病理類型、雌激素受體(ER)表達(dá)、孕激素受體(PR)表達(dá)、CerbB-2表達(dá)、Ki-67表達(dá)和分子分型均無相關(guān)(P＞0.05);hMAM表達(dá)與以上臨床病理因素均無相關(guān)(P＞0.05)。見表1。

表1 乳腺癌患者陰性前哨淋巴結(jié)中CK19和hMAM的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系(n，%)

3 討論

前哨淋巴結(jié)是乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一站淋巴結(jié)，它的組織學(xué)特征能準(zhǔn)確預(yù)測腋窩淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移，現(xiàn)認(rèn)為乳腺癌SLNB陰性，則無需行腋窩淋巴結(jié)清掃(ALND)，對(duì)腋窩淋巴結(jié)陰性的乳腺癌患者行ALND，并不能提高其總體生存率和延長無病生存期［1］。這對(duì)乳腺癌患者來說可以減小手術(shù)創(chuàng)傷、促進(jìn)術(shù)后上肢功能恢復(fù)并提高術(shù)后生活質(zhì)量。同時(shí)，若對(duì)無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者行ALND，破壞腋窩淋巴結(jié)的免疫屏障作用，更易于隱藏的癌灶向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］。所以前哨淋巴結(jié)病理檢查結(jié)果至關(guān)重要。但常規(guī)病理學(xué)檢測前哨淋巴結(jié)陰性尚不能認(rèn)為腋窩淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移，因?yàn)槌Ｒ?guī)病理HE染色對(duì)直徑＜2 mm微小轉(zhuǎn)移灶較難檢出，有研究報(bào)道常規(guī)病檢前哨淋巴結(jié)陰性患者，5年內(nèi)仍有30%出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移［3］。這可能是前哨淋巴結(jié)早期出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移，常規(guī)病檢呈假陰性而漏診所致。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)或多層切片HE染色、免疫組化、RT-PCR檢測均可顯著提高前哨淋巴結(jié)敏感性，而RT-PCR檢測敏感性更高，并且少量切片即可診斷微轉(zhuǎn)移，前兩者聯(lián)合可使微轉(zhuǎn)移檢出率提高9%～47%［4-5］。連續(xù)切片工作煩瑣和費(fèi)時(shí)，在臨床應(yīng)用難以開展。本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本為蠟塊，所以采用免疫組化對(duì)陰性前哨淋巴結(jié)進(jìn)行檢測，以提高微轉(zhuǎn)移檢出率。

CK19和hMAM均在正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，而在間葉組織來源的淋巴結(jié)、外周血、骨髓等中不表達(dá)，因此可以作為乳腺癌的良好標(biāo)志物來進(jìn)行微轉(zhuǎn)移灶的檢測［6-7］。CK19是乳腺癌淋巴結(jié)隱匿轉(zhuǎn)移癌檢測的可靠基因標(biāo)志之一，在上皮性腫瘤患者的前哨淋巴結(jié)中檢測到CK19的表達(dá)，即表明有播散的腫瘤細(xì)胞的存在。張濤等［8］報(bào)道用CK19前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢出率約64.7%，且微轉(zhuǎn)移與腫瘤大小、CerbB-2等因素表達(dá)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法對(duì)60例乳腺癌陰性前哨淋巴結(jié)行CK19和hMAM檢測。本實(shí)驗(yàn)中CK19微轉(zhuǎn)移檢出率為13.3%(8/60)，從表1中得知，經(jīng)單因素分析CK19的表達(dá)僅與T分期即乳腺腫瘤的大小相關(guān)，與其他臨床病理因素均不相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為臨床檢查無腋窩淋巴結(jié)腫大的早期乳腺癌患者，均處于T1～T2 N0M0，同樣證實(shí)腫瘤大小與微轉(zhuǎn)移相關(guān)，這也符合腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移特性隨著瘤體積增大而增強(qiáng)，臨床分期越晚，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率越高的規(guī)律，所以腫瘤的大小可用作評(píng)估該類患者微轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)。所以當(dāng)乳腺癌腫瘤直徑＞2 cm時(shí)，應(yīng)注意陰性前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移情況。

CerbB-2基因是在乳腺癌中增殖表達(dá)的原癌基因，已證實(shí)在乳腺癌中CerbB-2的高表達(dá)可表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲性，也提示有較高的轉(zhuǎn)移潛能，所以這類患者腫瘤惡性程度高且易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。但本研究中微轉(zhuǎn)移與CerbB-2的表達(dá)無相關(guān)，這可能和本研究中Luminal B型及HER2過表達(dá)型例數(shù)較多、CerbB-2表達(dá)比例較高有關(guān)。國內(nèi)學(xué)者從乳腺癌患者骨髓和外周血中檢測CK19等微轉(zhuǎn)移，同樣發(fā)現(xiàn)乳腺癌微轉(zhuǎn)移與腫瘤大小及臨床分期等臨床病理因素相關(guān)［9-10］。所以檢測前哨淋巴結(jié)中CK19可發(fā)現(xiàn)更早期微轉(zhuǎn)移病灶，如聯(lián)合外周血或骨髓中微轉(zhuǎn)移檢測，將會(huì)更好地早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移。

William等［11］檢測了HE染色陰性的淋巴結(jié)中hMAM陽性表達(dá)率為33%(112/344)，且hMAM的陽性表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)分期、St.Gallen危險(xiǎn)度均呈正相關(guān)(P值分別0.0255與0.022)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果hMAM的檢出率為3.33%(2/60)，表達(dá)強(qiáng)度(+)～(++)，且表達(dá)與以上臨床病理因素均不相關(guān)。在本試驗(yàn)中hMAM這一指標(biāo)檢出率低，表達(dá)強(qiáng)度偏低，與William的結(jié)果差距較大，可能與本組中的病例數(shù)偏少和標(biāo)本有關(guān)。由于本研究的標(biāo)本為蠟塊而非新鮮組織，并且前哨淋巴結(jié)于術(shù)中均接受快速冰凍病理檢查，冰凍剩余組經(jīng)常規(guī)處理接受常規(guī)HE染色，由于兩次檢測需獲得最大平面，致使剩余組織量明顯減少，并且每個(gè)蠟塊僅切片3張，也是本實(shí)驗(yàn)陽性檢測較少的原因。所以hMAM用于陰性前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢測的靈敏度可能需要大樣本實(shí)驗(yàn)才能明確。

Cox等［12］回顧分析2408例乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移后具有重要的預(yù)后意義?？傊?，快速正確地診斷前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，對(duì)乳腺癌患者手術(shù)方式，術(shù)后治療、預(yù)后生存等均至關(guān)重要。雖然本試驗(yàn)樣本例數(shù)較少，但仍能檢測到微轉(zhuǎn)移的存在，所以開展常規(guī)病檢陰性前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢測有較好的臨床應(yīng)用意義。

［1］Fisher B，Jeong JH，Anderson S，et al.Twenty-five-year follow-up of a randomized trial comparing radical mastectomy，total mastectomy，and total mastectomy followed by irradiation［J］.N Engl J Med，2002，347(8)：567-575.

［2］孫剛，馬斌林.老年乳腺癌與前哨淋巴結(jié)活檢［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2011，25(2)：113-118.

［3］Antonio M，F(xiàn)iamma B，Gloria B，et al.mRNA markers of breast cancer nodal metastases：comparison between mammaglobin and carcinoembryonic antigen in 248 patients［J］.J Pathol，2001，195(2)：186-190.

［4］Rivera M，Merlin S，Hoda RS，et al.Minimal involvement of sentinel lymph node in breast carcinoma：prevailing concepts and challenging problems［J］.Int J Surg Pathol，2004，12(4)：301-306.

［5］陸云飛，陳波，曾健，等.乳腺癌前哨淋巴結(jié)定位切除、微轉(zhuǎn)移檢測及其臨床意義［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2006，28(1)：25-28.

［6］Ishida M，Kitamura K，Kinoshita J，et al.Detection of micrometastasis in the sentinel lymph nodes in breast cancer［J］.Surgery，2002，131(1 Suppl)：S211-S216.

［7］Fleming TP，Watson MA.Mammaglobin，a breast-specific gene，and its utility as a marker for breast cancer［J］.Ann N Y Acad Sci，2000，923：78-89.

［8］張濤，張保寧，張宏圖，等.乳腺癌前哨淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移的檢測［J］.中華腫瘤雜志，2007，29(2)：116-118.

［9］王曉春，劉運(yùn)江，劉現(xiàn)義，等.hMAM RNA和CK19 RNA聯(lián)合檢測乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移［J］.中華腫瘤防治雜志，2007，14(9)：676-679.

［10］趙亞新，劉潔凡，孫維建，等.腋淋巴結(jié)陰性乳腺癌外周血CK19 mRNA表達(dá)［J］.中華腫瘤防治雜志，2010，17(24)：2022-2025.

［11］William E，Gillanders MD，Hebert R，et al.Molecular detection of micrometastatic breast cancer in histopathology-negative axillary lymph nodes correlates with traditional predictors of prognosis［J］.Annals of Surgery，2004，239(6)：828-840.

［12］Cox CE，Kiluk JV，Riker AI.Significance of sentinel node micrometastases in human breast cancer［J］.J Am Coll Surg，2008，206(2)：261-268.