劉 曉，周其岡，李 嬛，蔡寶昌，陳曉輝，畢開順

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210029;2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016; 3.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210029)

鹽酸阿比朵爾收載于《俄國藥典》XI第1卷，2003年經(jīng)SFDA批準(zhǔn)開始進(jìn)行第2類新藥臨床前和臨床研究。自1993年在俄羅斯上市以來，該藥物在俄羅斯、烏克蘭等俄聯(lián)邦國家已有10余年的臨床應(yīng)用歷史，其良好的療效和安全性已得到肯定，并被俄羅斯國家藥典委員會推薦給老人［1］和兒童［2－3］作為對抗甲型和乙型流感病毒感染的治療和預(yù)防藥物。目前，國內(nèi)對該藥物相關(guān)劑型的研制與開發(fā)不斷增加，作為新藥研究與開發(fā)的一部分重要內(nèi)容，本項工作報道鹽酸阿比朵爾在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究結(jié)果，以揭示其在大鼠體內(nèi)的變化規(guī)律，為其新藥研究與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 鹽酸阿比朵爾原料藥(HPLC法測定純度＞98.5%)與阿比朵爾對照品(HPLC法測定純度＞99.5%)均由沈陽中?？萍奸_發(fā)有限公司提供(化學(xué)結(jié)構(gòu)如Fig 1A)。內(nèi)標(biāo)物(6-溴-4-吡咯基甲基-5-羥基-1-甲基-2-苯硫基甲基-吲哚-3-羧酸乙酯，純度＞98.0%，化學(xué)結(jié)構(gòu)如Fig 1B)由沈陽藥科大學(xué)藥物化學(xué)實驗室合成。甲醇(色譜純)購自加拿大Calepure公司;乙腈(色譜純)、氫氧化鈉(分析純)、甲酸(分析純)均購自天津大茂化學(xué)試劑廠。實驗用水為實驗室自制三重蒸餾水。

Fig 1 Chemical structures of arbidol(A)and internal standard(B)

1.2 實驗儀器 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為Shimadzu 2010 A系統(tǒng)，包括 LC-10ATvp液相色譜輸液泵，2010EV型單重四極桿質(zhì)譜儀，LC-MS Solution 3.0數(shù)據(jù)采集工作站(島津公司，日本);Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm;大連中匯達(dá)公司，中國)，偶聯(lián)Kromasil C18保護(hù)柱(10 mm ×4.6 mm，5 μm;大連中匯達(dá)公司，中國)。AB135-S電子天平(METTLER TOLEDO公司，瑞典)、CAY-1液體快速混合器(北京長安儀器廠)、DK-98-1電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、超聲波發(fā)生器(浙江象山石浦海天電子儀器廠)、TGL-16C離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 實驗動物 健康♂Wistar系大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心提供，給藥前禁食12 h，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 以甲醇－0.1%甲酸水溶液(78∶22，V/V)為流動相，恒速洗脫，流速為0.8 ml· min－1，柱溫為室溫，進(jìn)樣體積為20 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源;檢測方式為選擇正離子監(jiān)測(SIM+);CDL溫度250℃;加熱塊溫度200℃;霧化氣(N2)流速1.51·min－1;干燥氣(N2)流速21·min－1;檢測電壓1.6 kV;用于定量分析的離子分別為 m/z 479.0+(阿比朵爾)和 m/z 504.9+(內(nèi)標(biāo))。

2.1.3 血漿樣品預(yù)處理 在避光條件下，取大鼠血漿樣品200 μl置于10 ml帶塞離心試管中，加入甲醇20 μl，內(nèi)標(biāo)液50 μl，振搖，再加入0.1 mol·L－1的NaOH溶液200 μl和乙醚3 ml，渦旋混合3 min，4 000 r·min－1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一干燥試管中，40℃水浴中氮氣吹干，殘留物以100 μl甲醇溶解，超聲30 s，渦旋2 min，轉(zhuǎn)移至200 μl EP管中，12 000 r·min－1高速離心10 min后，上清液20 μl進(jìn)樣HPLC-MS系統(tǒng)分析。

2.1.4 受試藥物的配制 分別精密稱取鹽酸阿比朵爾原料藥0.018、0.036、0.108 g，先加無水乙醇0.2 ml使其完全溶解，再用氯化鈉注射液稀釋至20 ml，搖勻，得濃度分別為0.9、1.8、5.4 g·L－1的鹽酸阿比朵爾混懸液，新鮮配制，用于灌胃給藥。

2.1.5 藥代動力學(xué)研究 18只♂ Wistar大鼠，隨機分成3組，每組6只，分別以9、18、54 mg·kg－1劑量灌胃方式給藥，并于給藥前(0 h)和給藥后0.033、0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、9、12 h由眼眶靜脈叢取血0.5 ml于肝素預(yù)處理過的離心試管中，4 000 r·min－1離心5 min，分離上層血漿，－20℃保存待測。

2.2 結(jié)果

2.2.1 色譜質(zhì)譜行為 取大鼠空白血漿200 μl，按“1.2.3”項下操作(不加入內(nèi)標(biāo))進(jìn)樣20 μl，得色譜圖Fig 2A;將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，同法操作，得色譜圖Fig 2B。阿比朵爾和內(nèi)標(biāo)物的保留時間分別為3.4 min和3.7 min。取大鼠灌胃給藥后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖Fig 2C。結(jié)果表明，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和藥物的代謝產(chǎn)物對血漿中阿比朵爾和內(nèi)標(biāo)的測定均無干擾。

Fig 2 Typical SIM chromatograms of arbidol and IS in plasma samples

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 取大鼠空白血漿200 μl，分別加入阿比朵爾標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20 μl，制成相當(dāng)于阿比朵爾濃度為1、2.5、10、100、500、1 000 μg·L－1的模擬血漿樣品，除不加入甲醇外按“1.2.3”項下操作，進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖，以阿比朵爾濃度(X)為橫坐標(biāo)，阿比朵爾與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運算，求得的直線回歸方程為:^Y=1.88 X ×10－3+1.08×10－2(r=0.9973，n=3)。阿比朵爾在1～1 000 μg·L－1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，定量下限為1 μg·L－1。

2.2.3 精密度和準(zhǔn)確度 取大鼠空白血漿200 μl，按“1.2.3”項下操作制成低、中、高3個濃度(2.5、100、800 μg·L－1)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每個濃度6樣本分析，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算QC樣品的測得濃度。對測定結(jié)果進(jìn)行方差分析，考察方法的日內(nèi)與日間精密度，結(jié)果見Tab 1，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合生物樣品測定的相關(guān)要求。

Tab 1 Intra-and inter-day precision and accuracy(n=6)

2.2.4 提取回收率 取大鼠空白血漿200 μl，按“2.2”項下操作制成低、中、高3個濃度(2.5、100、800 μg·L－1)的模擬血漿樣品，進(jìn)樣分析，每個濃度6樣本，以提取后的阿比朵爾峰面積與未經(jīng)提取的標(biāo)準(zhǔn)液直接進(jìn)樣獲得的相應(yīng)濃度色譜峰面積之比，考察方法的絕對提取回收率。3種濃度下藥物的平均提取回收率分別為87%、74.2%、72.1%;RSD分別為7.7%、9%、8%。同法測定內(nèi)標(biāo)的提取回收率為80%，RSD為8%。結(jié)果表明，方法回收率良好。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗 取大鼠空白血漿200 μl，按2.2項下操作制成低、中、高3個濃度(2.5、100、800 μg·L－1)的模擬血漿樣品，進(jìn)樣分析，每個濃度3樣本，考察血漿樣品室溫放置4 h，－20℃凍藏30 d和經(jīng)歷3次凍融循環(huán)周期后的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，含有阿比朵爾的血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。結(jié)果見Tab 2。

2.2.6 藥代動力學(xué) 采用上述已建立的分析方法測定9、18 mg·kg－1劑量組的血漿樣品;54 mg· kg－1劑量組的血漿樣品依照課題組前期建立方法測定［4］。得到的藥動學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)DAS 2.0軟件處理，單劑量灌胃(9、18、54 mg·kg－1)給予大鼠鹽酸阿比朵爾后，藥物在大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)如Tab 3所示，平均血藥濃度–時間曲線如Fig 3。

Fig 3 Mean plasma concentration-time curves for arbidol in rat plasma(n=6)

低、中、高3個劑量組分別灌胃給予大鼠鹽酸阿比朵爾后，各個劑量組的平均Cmax分別為(644.1± 543.9)、(1002±298)、(4711±2361)μg·L－1。將得到的Cmax數(shù)據(jù)對劑量作相關(guān)分析，結(jié)果表明:藥物的Cmax在實驗劑量范圍內(nèi)具有線性動力學(xué)特征(r= 0.814 2，P＜0.001);以梯形法計算0到t時刻的AUC0－t，將上述3個劑量組的藥物AUC0－t數(shù)據(jù)對劑量作相關(guān)分析，結(jié)果表明:藥物的AUC0－t在實驗劑量范圍內(nèi)具有線性動力學(xué)特征(r=0.8397，P＜ 0.001);各劑量組的數(shù)據(jù)經(jīng)秩和檢驗分析差異無顯著性(P＞0.05)。

Tab 2 Stability of arbidol in rat plasma(±s，n=3)

Tab 2 Stability of arbidol in rat plasma(±s，n=3)

Concentration spiked/μg·L－1thaw stability Bias(RE%) Short-term room temperature stability(4 h) Freeze and Bias(RE%) Long-term cold storage stability(30 d) Bias(RE%) 2.5 2.5±0.3 0.58 2.3±0.1 －7.9 2.4±0.1 －5.7 100 91.3±1.3 －8 110.5±0.5 10 109.4±1.9 －9 800 737.7±26.3 －7.8 789.8±1.5 －1.3 901±14 12

Tab 3 Pharmacokinetic data of arbidol in rats following oral administration of single dose(±s，n=6)

Tab 3 Pharmacokinetic data of arbidol in rats following oral administration of single dose(±s，n=6)

Dose /mg·kg－1 /h 9 644.1±543.9 0.35±0.17 1 127±970 1 250±1 070 3 Parameter Cmax/μg·L－1 Tmax/h AUC0－t/μg·h·L－1 AUC0－∞/μg·h·L－1 T 1 2.2±1.2 18 1002±298 0.28±0.11 1 956±895 2 224±1 058 3.6±1.2 54 4711±2361 0.18±0.06 6 790±2749 7 558±2 877 3.3±0.7

3 討論

據(jù)報道，阿比朵爾溶液對光線敏感［5］。實驗中考察了光線對鹽酸阿比朵爾甲醇溶液穩(wěn)定性的影響。將濃度為100 g·L－1的鹽酸阿比朵爾甲醇溶液置于室溫日光下照射6 h后測定，其藥物含量僅為初始的12%，其降解過程符合一級動力學(xué)規(guī)律(r= 0.991 8)，半衰期為2 h。但是，鹽酸阿比朵爾溶液只對日光敏感，而室內(nèi)照明光線對其穩(wěn)定性卻無明顯影響，故推測該降解過程主要系紫外線導(dǎo)致，并提示在其相關(guān)劑型開發(fā)過程中應(yīng)采取避光材料包裝。

考察擬開發(fā)的新藥是否有發(fā)展前途，優(yōu)良的藥代動力學(xué)參數(shù)是重要的指標(biāo)之一［6］。鹽酸阿比朵爾在大鼠體內(nèi)吸收迅速，灌胃給藥20 min后血藥濃度即出現(xiàn)最大值。分別單次灌胃給予大鼠低、中、高(9、18、54 mg·kg－1)3個劑量的鹽酸阿比朵爾后，其在動物體內(nèi)的藥物動力學(xué)行為具有線性特征，在實驗的劑量范圍內(nèi)Cmax和AUC0－t均呈現(xiàn)劑量依賴式的增長趨勢。各劑量組間的經(jīng)非參數(shù)檢驗差異沒有顯著性，說明在實驗的劑量范圍內(nèi)藥物可以在大鼠體內(nèi)正常的代謝并順利消除，即使在高劑量時仍未發(fā)現(xiàn)明顯的蓄積和飽和現(xiàn)象，暗示其臨床使用安全性良好。

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