沈 磊，崔文玉，陳汝筑，汪 海

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850;2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，廣東廣州 510080)

失敏(desensitization)是指在反復(fù)或長時(shí)間激動(dòng)劑刺激下，生物學(xué)反應(yīng)降低或消失的一種可逆現(xiàn)象，被認(rèn)為是一種暫時(shí)性失活［1］。作為第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有失敏過程的受體，煙堿樣乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)是一類含半胱氨酸環(huán)的配體門控離子通道受體，由5個(gè)亞基構(gòu)成［2］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布的1個(gè)N受體亞型是α7型煙堿樣乙酰膽堿受體(α7-nAChR)，它由5個(gè)相同的α亞單位組成，以快失敏和對(duì)鈣離子的高通透性而有別于其他類型的N受體［3－4］。快失敏這個(gè)特征具有很重要的作用，在生理狀態(tài)下參與了細(xì)胞保護(hù)，避免細(xì)胞受激動(dòng)劑作用后的過度興奮，也參與了神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)，并參與了突觸可塑性對(duì)其他受體功能的調(diào)節(jié)。病理?xiàng)l件下參與了長期吸煙后的成癮癥狀和有機(jī)磷中毒癥狀［5－6］。所以研究 α7-nAChR的失敏特征有助于理解失敏態(tài)N受體的特殊功能。本文使用膜片鉗全細(xì)胞記錄方式來探討α7-nAChR的特異激動(dòng)劑——膽堿對(duì)海馬神經(jīng)元中含α7-nAChR失敏過程的影響。

1 材料與方法

1.1 新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取12 h內(nèi)出生的Sprague-Dawley大鼠，經(jīng)75%乙醇浸泡消毒后，取全腦放入0℃的高糖DMEM培養(yǎng)液中沖洗，在解剖顯微鏡下分離出海馬組織，并仔細(xì)剝離附著血管膜和皮層組織，然后用小鑷子將海馬搗碎，放入含2 g· L－1木瓜蛋白酶的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%二氧化碳孵箱中消化20 min，用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中止消化，然后以1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，重懸于DMEM/F12培養(yǎng)液，用不同口徑的滴管分批次輕輕吹打分散細(xì)胞，將分散好的細(xì)胞懸液加入預(yù)先涂了多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中(在4℃放置過夜后吸出備用)，于37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)1 d后將含血清培養(yǎng)液全部換為無血清并含2%B-27的Neurobasal-A培養(yǎng)液(該無血清培養(yǎng)液可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長，而加入B-27可保證神經(jīng)元的正常生長)，以后每3天用無血清培養(yǎng)液半量換液1次。膜片鉗實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)10～15 d，有明顯的胞體和神經(jīng)突觸的神經(jīng)元。

1.2 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn) 使用MultiClamp 700B放大器和pClamp9.2軟件采集和分析數(shù)據(jù)。記錄電極用硬質(zhì)有芯玻璃經(jīng)電極拉制儀拉制而成，電阻為2～4 MΩ。用細(xì)胞外液替換培養(yǎng)液，記錄電極與細(xì)胞表面形成高阻封接后電擊破膜形成全細(xì)胞記錄模式。補(bǔ)償膜電容和串聯(lián)電阻后將細(xì)胞膜電位鉗制于－80 mV，被動(dòng)記錄受體介導(dǎo)電流。采樣頻率為5 kHz，低通濾波頻率為2 kHz。給藥方式有兩種，激動(dòng)劑由微量注射儀(PicospritzerⅢ)向細(xì)胞表面噴射給予，給藥后立即移出培養(yǎng)皿，阻斷劑由蠕動(dòng)泵灌流給予(2 ml·min－1)。細(xì)胞外液的組成為(mmol ·L－1):NaCl 140，KCl 5，MgCl21，CaCl22，D-glucose 10，HEPES 10，用NaOH調(diào)pH 7.4。加入0.5 μmol ·L－1TTX阻斷自發(fā)性動(dòng)作電位產(chǎn)生。電極內(nèi)液的組成為(mmol·L－1):CsCH3SO3130，CsCl 6，MgCl22，MgATP 4，EGTA 2，HEPES 10，用 CsOH調(diào) pH 7.2。所有實(shí)驗(yàn)在室溫(22℃ ～25℃)下進(jìn)行。記錄全過程均用正常外液進(jìn)行灌流。

1.3 試劑 Choline、Methyllycaconitine(MLA)、αbungarotoxin(α-BGT)、Tetrodotoxin(TTX)、Mg-ATP、HEPES、多聚賴氨酸均為Sigma公司產(chǎn)品。DMEM、DMEM/F12、B-27、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。

1.4 數(shù)據(jù)分析 誘發(fā)電流用pClamp9.2軟件測(cè)量分析，電流衰減部分用單指數(shù)方程擬合。數(shù)據(jù)用ˉx ±s表示，n表示細(xì)胞數(shù)，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，組間比較采用LSD法。使用Origin 8.1軟件進(jìn)行作圖，用Boltzmann擬合失敏恢復(fù)曲線。

2 結(jié)果

2.1 α7-nAChR介導(dǎo)電流的電生理學(xué)特征 將細(xì)胞膜電位鉗制在－80 mV，向形成全細(xì)胞模式的海馬神經(jīng)元表面局部噴射10 mmol·L－1膽堿1s可誘發(fā)出一內(nèi)向電流，該電流具有快激活和快失活的動(dòng)力學(xué)過程。在所記錄的117個(gè)細(xì)胞中，有90個(gè)細(xì)胞對(duì)膽堿有反應(yīng)，舍棄電流峰值＜100 pA的數(shù)值(8個(gè))后，電流的峰值為(875±51)pA、10%～90%上升時(shí)間(反應(yīng)激活過程)為(21±2)ms、對(duì)失活過程進(jìn)行單指數(shù)擬合后得到失敏時(shí)間常數(shù)tau為(77± 5)ms(n=82)。膽堿誘發(fā)電流可以被MLA完全可逆阻斷，持續(xù)灌流含10 nmol·L－1MLA的外液5 min可以使電流峰值降為0，而換為正常外液洗脫20 min后，電流峰值恢復(fù)到正常水平的68.3% ± 3.4%(n=4);該電流也可以被α-BGT完全不可逆阻斷，持續(xù)灌流含100 nmol·L－1α-BGT的外液5 min使電流峰值降為正常水平的5.3% ±2.7%，而換為正常外液洗脫30 min后仍然無膽堿誘發(fā)電流出現(xiàn)(n=3)，兩種阻斷劑的特異性阻斷進(jìn)一步證明膽堿誘發(fā)電流為α7-nAChR介導(dǎo)電流。有些膽堿誘發(fā)電流在結(jié)束給藥后會(huì)出現(xiàn)rebound電流(反跳電流)，這是因?yàn)樵诒┞队诟邼舛燃?dòng)劑時(shí)，一部分開放的通道被激動(dòng)劑所阻斷，而在移除激動(dòng)劑后恢復(fù)開放的現(xiàn)象［7］。(Fig 1)

Fig 1 Characteristics of choline-evoked currents in cultured hippocampal neurons

2.2 高濃度膽堿誘導(dǎo)α7-nAChR的失敏特征

2.2.1 高濃度膽堿對(duì)受體激活和失敏的時(shí)-效關(guān)系影響 將細(xì)胞膜電位鉗制在－80 mV，向形成全細(xì)胞模式的海馬神經(jīng)元表面局部噴射不同時(shí)間的10 mmol·L－1膽堿可以得到一系列膽堿誘發(fā)電流。10、20、50、100、200、500、1 000和10 000 ms的膽堿誘發(fā)電流的標(biāo)準(zhǔn)化電流幅度(以1 000 ms膽堿誘發(fā)電流幅度為100%)分別為:7.0%±3.5%、31.0% ±8.4%、93.9% ±6.4%、100.0% ±4.4%、100.5%±8.8%、93.7% ±3.9%、100.0% ±0.0 %和99.9%±4.0%(n=5);20、50、100、200、500、1 000和10 000 ms的膽堿誘發(fā)電流的10%～90%上升時(shí)間分別為:(38±8)、(23±4)、(15±3)、(16± 1)、(18±3)、(15±2)和(17±2)ms(n=5);20、50、100、200、500、1 000和10 000 ms的膽堿誘發(fā)電流的失敏時(shí)間常數(shù)(tau)分別為:(167±33)、(78± 25)、(59±13)、(57±14)、(42±11)、(49±13)和(72±22)ms(n=5)。這些數(shù)據(jù)說明當(dāng)給膽堿的時(shí)間≥100 ms時(shí)，不同給藥時(shí)間對(duì)α7-nAChR的激活和失敏過程基本無影響(Fig 2)。

2.2.2 高濃度膽堿刺激時(shí)間對(duì)受體失敏恢復(fù)的影響 將細(xì)胞膜電位鉗制在－80 mV，采用配對(duì)刺激研究給膽堿不同時(shí)間對(duì)α7-nAChR失敏恢復(fù)的影響。配對(duì)刺激含有一個(gè)條件刺激(給予不同時(shí)間的膽堿)和間隔一定時(shí)間后的一個(gè)測(cè)試刺激(給100 ms的膽堿)，每對(duì)刺激間隔120 s以保證受體功能完全恢復(fù)。結(jié)果為:當(dāng)給予100 ms的膽堿作為條件刺激時(shí)，受體完全失敏的時(shí)間≤5 s，受體從失敏態(tài)恢復(fù)一半所需時(shí)間為(28.6±5.7)s(n=4);當(dāng)給予1 s的膽堿作為條件刺激時(shí)，受體完全失敏的時(shí)間≤10 s，受體從失敏態(tài)恢復(fù)一半所需時(shí)間為(32.4± 2.4)s(n=6);而當(dāng)給予10 s的膽堿作為條件刺激時(shí)，受體完全失敏的時(shí)間≤20 s，受體從失敏態(tài)恢復(fù)一半所需時(shí)間為(31.1±1.1)s(n=4)，3種條件刺激下受體從失敏恢復(fù)的半數(shù)恢復(fù)時(shí)間兩兩比較差異無顯著性。這些數(shù)據(jù)說明延長高濃度膽堿的作用時(shí)間不影響α7-nAChR從失敏態(tài)的恢復(fù)，但可以延長α7-nAChR的完全失敏時(shí)間(Fig 3)。

Fig 2 Effects of choline at the concentration of 10 mmol·L－1on activation and desensitization of choline-evoked currents in cultured hippocampal neurons

2.3 低濃度膽堿誘導(dǎo)的α7-nAChR的失敏特征將細(xì)胞膜電位鉗制在－80 mV，加入100、50和10 μmol·L－1膽堿持續(xù)灌流海馬神經(jīng)元誘導(dǎo) α7-nAChR失敏，之后用正常外液洗脫觀察受體從失敏態(tài)的恢復(fù)。于正常期、失敏期和洗脫期用10 mmol ·L－1膽堿給100 ms測(cè)試受體功能。結(jié)果為:用含100 μmol·L－1膽堿的細(xì)胞外液作用神經(jīng)元1、3、6和10 min后可使10 mmol·L－1膽堿誘發(fā)電流下降到正常對(duì)照電流水平的75.2%±12.1%、47.0%± 16.2%、15.7%±3.5%和8.1% ±0.6%，用正常外液洗脫后的1、3、6和10 min使電流恢復(fù)到正常對(duì)照電流水平的35.0% ±11.4%、61.0% ±8.2 %、68.8%±9.3%和80.3%±4.8%(n=5);用含50 μmol·L－1膽堿的細(xì)胞外液作用神經(jīng)元1、3、6和10 min后使10 mmol·L－1膽堿誘發(fā)電流下降到正常對(duì)照電流水平的92.8% ±1.3%、70.8% ±4.3 %、46.4%±5.1%和41.6%±4.1%，用正常外液洗脫后的1、3、6和10 min使電流恢復(fù)到正常對(duì)照電流水平的 49.9% ±5.1%、68.0% ±1.8%、69.8%±1.8%和74.7% ±0.6%(n=4);而用含10 μmol·L－1膽堿的細(xì)胞外液作用神經(jīng)元1、3、6和10 min后，10 mmol·L－1膽堿誘發(fā)電流水平為正常對(duì)照電流水平的97.4% ±2.6%、104.2% ±5.2 %、96.9%±5.9%和94.1%±8.4%，用正常外液洗脫后的1、3、6和10 min誘發(fā)電流為正常對(duì)照電流水平的94.5%±7.2%、92.8%±4.1%、96.4% ±3.2%和95.9%±2.2%(n=4)。這說明盡管低濃度膽堿激動(dòng)α7-nAChR的能力不夠(100 μmol· L－1膽堿誘發(fā)電流幅度為 10 mmol·L－1膽堿的19%，數(shù)據(jù)未列出)，但足以使受體失敏，失敏程度隨激動(dòng)劑濃度和作用時(shí)間的增加而加深(Fig 4)。

Fig 3 Effects of choline at the concentration of 10 mmol·L－1 on recovery from desensitization of choline-evoked currents in cultured hippocampal neurons

3 討論

作為記憶和認(rèn)知功能形成的中樞，海馬含有豐富的神經(jīng)元型nAChR，接受內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)—ACh后調(diào)控其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放或者直接產(chǎn)生突觸后效應(yīng)。海馬中的 N受體有多種亞型，如 α4β2、α4α5β2、α3β4、α7等，其中α7型受體介導(dǎo)的電流對(duì)MLA和α-BGT敏感［8］。膽堿是α7-nAChR的選擇性激動(dòng)劑，本實(shí)驗(yàn)中用10 mmol·L－1膽堿誘發(fā)電流為快激活和快失活電流，且能被10 nmol·L－1的MLA和100 nmol·L－1的α-BGT完全阻斷，說明該電流為膽堿激活α7-nAChR引起。

以膽堿為工具藥研究海馬神經(jīng)元α7-nAChR的失敏特征，發(fā)現(xiàn):(1)10 mmol·L－1膽堿(高濃度)誘導(dǎo)的α7-nAChR的失敏速度很快;(2)10 mmol·L－1膽堿誘導(dǎo)的α7-nAChR從失敏態(tài)恢復(fù)的速度也很快(3)當(dāng)給藥時(shí)間≥100 ms時(shí)，延長高濃度膽堿的作用時(shí)間并不影響α7-nAChR的失敏速度;延長作用時(shí)間也不影響受體從失敏態(tài)的恢復(fù);但是延長作用時(shí)間延長了受體處在完全失敏態(tài)的時(shí)間。這說明只要給藥時(shí)間足夠誘發(fā)完整電流，α7-nAChR的失敏及其恢復(fù)就與給藥時(shí)間無關(guān)，暴露于激動(dòng)劑更長時(shí)間可能僅僅只是增加了受體對(duì)下一場(chǎng)刺激的絕對(duì)不應(yīng)期;(4)低濃度膽堿(≤100 μmol·L－1)持續(xù)灌流也可以使受體緩慢失敏，失敏程度與膽堿的濃度有關(guān);而失敏恢復(fù)的程度未觀察到與膽堿的濃度有關(guān)，這可能是由于洗脫時(shí)間不夠長(約10 min)，100和50 μmol·L－1膽堿誘發(fā)的受體失敏還未完全恢復(fù)。

Fig 4 Desensitization of choline-evoked currentsto choline at the concentration of 100，50 and 10 μmol·L－1in cultured hippocampal neurons

自從Katz和Thesleff從骨骼肌N受體發(fā)現(xiàn)受體失敏現(xiàn)象后［9］，經(jīng)典的失敏就是繼發(fā)于受體的激活，即靜息態(tài)受體被激動(dòng)劑誘發(fā)為激活態(tài)后馬上變構(gòu)為失敏態(tài)。之后這種理論又補(bǔ)充了低濃度激動(dòng)劑(無明顯誘發(fā)電流產(chǎn)生的濃度)慢性孵育也可以誘發(fā)受體失敏的內(nèi)容，這是由于失敏態(tài)受體對(duì)于激動(dòng)劑的親和力遠(yuǎn)高于激活態(tài)受體，因此低濃度激動(dòng)劑使受體越過激活態(tài)而直接進(jìn)入失敏態(tài)，這種失敏也被稱為“高親和力失敏”(high-affinity desensitization，HAD)［10－11］。HAD對(duì)于膽堿的生理作用可能更為重要，因?yàn)橄啾容^ACh在突觸間隙的瞬間高濃度激動(dòng)受體的作用，作為ACh水解產(chǎn)物的膽堿在生理?xiàng)l件下的細(xì)胞外液濃度為4～10 μmol·L－1［12］，該濃度很難激活大量α7-nAChR，然而在反復(fù)的沖動(dòng)傳遞過程中，膽堿濃度有可能累計(jì)，從而產(chǎn)生HAD來限制ACh對(duì)突觸后細(xì)胞的過度興奮來保護(hù)細(xì)胞。

總的來說，隨著失敏態(tài)α7-nAChR的功能越來越被重視，本實(shí)驗(yàn)為應(yīng)用膽堿來研究α7-nAChR的失敏功能提供了依據(jù)。

［1］ Quick M W，Lester R A.Desensitization of neuronal nicotinic receptors［J］.J Neurobiol，2002，53(4):457－78.

［2］ Gotti C，Zoil M，Clementi F.Brain nicotinic acetylcholine receptors:native subtypes and their relevance［J］.Trends Pharmacol Sci，2006，27(9):482－91.

［3］ Albuquerque E X，Pereira E F，Alkondon M，et al.Mammalian nicotinic acetylcholine receptors:from structure to function［J］.Physiol Rev，2009，89(1):73－120.

［4］ 殷曉峰，崔文玉，胡 剛，等.培養(yǎng)大鼠頸上神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膽堿誘發(fā)電流的特征［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(1):89－94.

［4］ Yin X F，Cui W Y，Hu G，et al.The characteristics of choline-evoked current in cultured rat superior cervical ganglia neurons［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(1):89－94.

［5］ Giniatullin R，Nistri A，Yakel J L.Desensitization of nicotinic ACh receptors:shaping cholinergic signaling［J］.Trends Neurosci，2005，28(7):371－8.

［6］ 張 捷，崔文玉，汪 海.神經(jīng)元N受體功能失敏對(duì)M受體拮抗劑藥理作用的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(8):997－1001.

［6］ Zhang J，Cui W Y，Wang H.Effect on antagonism of muscarinic acetylcholine receptors antagonists by desensitization of nicotinic acetylcholine receptors［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8): 997－1001.

［7］ Sokolova E，Matteoni C，Nistri A.Desensitization of neuronal nicotinic receptors of human neuroblastoma SH-SY5Y cells during short or long exposure to nicotine［J］.Br J Pharmacol，2005，146 (8):1087－95.

［8］ Albuquerque E X，Pereira E F，Castro N G，et al.Neuronal nicotinic receptors:function，modulation and structure［J］.Seminars Neurosci，1995，7(2):91－101.

［9］ Katz B，Thesleff S.A study of the“desensitization”produced by acetylcholine at thr motor end-plate［J］.J Physiol，1957，138 (1):63－80.

［10］Paradiso K G，Steinbach J H.Nicotine is highly effective at producing desensitization of rat α4β2 neuronal nicotinic receptors［J］.J Physiol，2003，553(3):857－71.

［11］Allison A F，Susmita C，Selena E B.Neuronal nicotinic acetylcholine receptors:neuroplastic changes underlying alcohol and nicotine addictions［J］.Front Mol Neurosci，2012，83(5):1－18.

［12］Alkondon M，Pereira E F，Cortes W S，et al.Choline is a selective agonist of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors in the rat brain neurons［J］.Eur J Neurosci，1997，9(12):2734－42.