張丹鳳，郝 麗，徐星銘，閆軍放，丁 楠

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，安徽合肥 230601;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，安徽合肥 230022)

雷公藤多苷(tripteryium wilfordii polyglycosidium，TWP)是植物雷公藤的根提取物，廣泛應(yīng)用于腎小球疾病、風(fēng)濕性疾病、腫瘤及移植等［1］。長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生肝功能受損和白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)，對(duì)性腺的損傷尤為突出，可引起月經(jīng)紊亂，甚至卵巢早衰［1］。如何在充分發(fā)揮TWP療效的同時(shí)，最大限度地降低其副作用是臨床亟待解決的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)HPT能夠改善TWP所致育齡期女性卵巢功能減退或衰竭引起的圍絕經(jīng)期癥候群，維持血清中雌激素(E2)、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的正常水平，減少TWP對(duì)女性生殖系統(tǒng)的毒副作用［4］。

FOXL2基因是目前發(fā)現(xiàn)的決定卵巢分化最早的標(biāo)志性啟動(dòng)基因，其通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)，參與顆粒細(xì)胞增殖分化。本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從基因轉(zhuǎn)錄水平探討HPT對(duì)TWP所致卵巢早衰的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明♀小鼠30只，8周齡，體質(zhì)量25～28 g，清潔級(jí)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要材料與儀器 TWP為上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)110201;戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè))為法國(guó)先靈公司生產(chǎn)，廣州先靈藥業(yè)有限公司分裝，批號(hào)20110501;醋酸甲羥孕酮片為上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào):20110701;孕馬血清促性腺激素(PMSG)購(gòu)自內(nèi)蒙古赤峰博恩藥業(yè)有限公司;人絨毛膜促性腺激素(HCG)購(gòu)于寧波激素二廠(每支1000IU);性激素測(cè)定藥盒由天津九鼎生物工程公司提供;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑和Taq DNA聚合酶均產(chǎn)自美國(guó)Fermentas公司。ABI7500型熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品;GSM凝膠圖像分析管理系統(tǒng)為美國(guó)Sim公司Bio-pro CN-UV型產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 分組 選取30只♀昆明系小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分3組(每組10只)，灌胃給藥。

1.3.2 給藥 Control組:每天給予等量生理鹽水;TWP組: TWP 20mg·kg－1·d－1;TWP+HPT組:TWP 20 mg·kg－1· d－1+HPT(給予戊酸雌二醇0.2 mg·kg－1·d－1，至d 4，再加用醋酸甲羥孕酮片1.5 mg·kg－11次，兩藥同時(shí)停用1 d后重復(fù)下一療程)，5 d/每療程，共17療程。每周按體重調(diào)整給藥量［3－4］。

1.3.3 促排卵處理 17個(gè)療程后，對(duì)3組小鼠均進(jìn)行促排卵處理:腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)10 U，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10U，16～18 h后處死，取卵巢稱重及顆粒細(xì)胞的收集，采用眼球摘除取血法取血，靜置2 h后，2 500 r·min－1離心5 min，留取血清待檢。

1.3.4 血清性激素的測(cè)定 ELISA法測(cè)定血清中雌激素(E2)、黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的水平。

1.3.5 卵巢稱重及顆粒細(xì)胞的收集 將取出的卵巢剝離周圍脂肪和被膜后，用濾紙吸干，萬(wàn)分之一天平稱濕重，按公式計(jì)算卵巢指數(shù):卵巢指數(shù)/%=卵巢濕重(mg)/體重(g)× 100%;參照文獻(xiàn)進(jìn)行顆粒細(xì)胞收集［5］。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞FOXL2 mRNA的表達(dá) 按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，冰上操作將不同時(shí)間點(diǎn)的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板建立反應(yīng)體系(20 μl)。引物由TaKaRa公司合成，序列如下:FOXL2(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度73 bp)Forward primer 5'-GCGGACGCGCAGTCAAAGAGG-3'，Reverse primer 5'-TTCT CCGGTGTTGTCCCGCCT-3'。GAPDH(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度173 bp)Forward primer 5'-ACGGCACAGTCAAGGCCGAG-3'，Reverse primer 5'-ACCCTTCAAGTGGGC CCCGG-3'。反應(yīng)體系如下:總體積20 μl:2×Goldstar Taqman mixture 10 μl，DEPC H2O 7.2 μl，probe 0.8 μl，cDNA 0.2 μl。反應(yīng)條件: 95℃ 10 s，接以40個(gè)循環(huán):95℃ 15 s，0℃ 1min。實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)復(fù)孔并同時(shí)擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參照。反應(yīng)結(jié)束后，用7500 Fast Real-time PCR System軟件分析，繪制PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，mRNA水平以相對(duì)定量(relative quantification，RQ)表示。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TWP和HPT聯(lián)合用藥對(duì)小鼠血清性激素的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)30只小鼠全部存活。與Control組相比，TWP組小鼠卵巢分泌的E2水平明顯下降，垂體分泌的FSH、LH水平明顯升高，性激素變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。HPT組小鼠血清性激素水平與Control組相比變化無(wú)差異，與TWP組相比，E2水平明顯升高，垂體分泌的FSH、LH水平明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，Tab 1)。

Tab 1 Changes of levels of serum gonadal hormone in each group(±s，n=30)

Tab 1 Changes of levels of serum gonadal hormone in each group(±s，n=30)

＊＊P＜0.01 TWP vs control，△△P＜0.01 TWP+HPT vs TWP

Group E2/ng·L－1 LH/IU·L－1 FSH/IU·L －1 Control 6.9940±0.4971 1.2130±0.1529 1.3750±0.1018 TWP 5.0600±0.5319＊＊1.8960±0.2051＊＊1.8690±0.1348＊＊TWP+HPT 6.6400±0.8721△△1.3480±0.1642△△1.4010±0.1663△△

2.2 TWP和HPT聯(lián)合用藥對(duì)小鼠卵巢指數(shù)的影響 與Control組相比，TWP組小鼠卵巢指數(shù)明顯下降(P＜0.01)，而TWP+HPT組小鼠卵巢指數(shù)則無(wú)明顯差異(P＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Changes in humid index of ovaries(±s，n=10)

Tab 2 Changes in humid index of ovaries(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 TWP vs control;△△P＜0.01 TWP+HPT vs TWP

Group Humid of index ovaries/% Control 0.0434±0.0187 TWP 0.0367±0.0179* TWP+HPT 0.0448±0.0177△△

2.3 TWP和HPT聯(lián)合用藥對(duì)小鼠卵巢mRNA的影響 Fig 1顯示，與Control組相比，TWP組FOXL2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，其2－ΔΔCt值僅為0.473，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與TWP組相比，TWP+HPT組FOXL2 mRNA拷貝數(shù)增高，其2－ΔΔCt值為0.781，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

4 討論

TWP多環(huán)節(jié)的免疫抑制作用，使它在治療免疫性疾病中有著獨(dú)特的地位，并在臨床應(yīng)用中已取得了良好的療效［6］。但TWP對(duì)卵巢細(xì)胞毒副作用，使其在育齡和育齡前患者的長(zhǎng)期維持性治療中受到很大限制。本研究結(jié)果顯示，TWP組小鼠卵巢指數(shù)明顯下降，同課題組另一病理研究發(fā)現(xiàn)TWP組小鼠卵巢組織受損明顯，卵泡較小，各級(jí)卵泡均有明顯的減少，且閉鎖卵泡增多［7］。卵巢功能表現(xiàn)為高促性腺激素型受損，E2分泌明顯減少，血清FSH、LH水平明顯升高，提示雷公藤多苷對(duì)卵巢組織結(jié)構(gòu)及下丘腦-垂體-性腺軸均有明顯損害。本實(shí)驗(yàn)將從維持卵巢功能方面發(fā)揮重要作用的人類常染色體基因—FOXL2基因著手，探討其損傷機(jī)制。研究表明［8］，F(xiàn)OXL2基因位于3號(hào)染色體的3q23區(qū)域，在成年小鼠的卵泡細(xì)胞中高度表達(dá)，是卵泡的維持和顆粒細(xì)胞的分化必需基因，在FOXL2突變的小鼠，顆粒細(xì)胞不能完全轉(zhuǎn)換為立方形，從而導(dǎo)致次級(jí)卵泡的缺失及卵母細(xì)胞的閉鎖，進(jìn)而影響卵巢功能［9］。另外，F(xiàn)OXL2的失活則會(huì)增加StAR、CYP19、CYP11A和CCND2基因在小卵泡和未成熟卵泡中的表達(dá)從而加速卵泡的發(fā)育，導(dǎo)致原始卵泡增多，出現(xiàn)卵巢早衰［10－11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TWP組小鼠FOXL2 mRNA轉(zhuǎn)錄下調(diào)，提示TWP可能通過(guò)干擾FOXL2 mRNA轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)卵巢早衰表型。

Fig 1 FOXL2 mRNA expression levels from different groups(±s，n=10)

雌孕激素序貫性替代治療廣泛應(yīng)用于防治卵巢早衰及絕經(jīng)后相關(guān)癥狀［4］。對(duì)TWP致繼發(fā)性POF患者給予HPT，可以改善低性激素水平，維持月經(jīng)及第二性征，有效率達(dá)90.47%［2］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)正常小鼠周期及體內(nèi)性激素水平的變化［12］，在應(yīng)用TWP的同時(shí)伍用HPT，結(jié)果顯示，E2性激素水平和卵巢指數(shù)升高，LH和FSH水平降低，F(xiàn)OXL2 mRNA拷貝數(shù)增加，提示HPT對(duì)TWP所致雌性小鼠卵巢損傷有較好的保護(hù)作用，可以上調(diào)小鼠顆粒細(xì)胞FOXL2 mRNA轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育。

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