何海燕，尹永強(qiáng)，李宏杰，叢恬駪，康 毅，婁建石

(天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，天津 300070)

心律失常(cardiac arrhythmia)是心血管系統(tǒng)疾病常見的臨床表現(xiàn)形式，也是最為嚴(yán)重的病癥之一，有較高的發(fā)病率和致死率，嚴(yán)重威脅人類健康。缺血/再灌注常可引起心肌梗死、心肌細(xì)胞凋亡及心律失常。目前，臨床常規(guī)使用的抗心律失常藥物療效不突出，有文獻(xiàn)報(bào)道抗心律失常藥物總有效率僅為30% ～60%，遠(yuǎn)期療效也不甚理想［1-2］。很多藥物雖有一定療效，但有加重或致心律失常的危險(xiǎn)［3］。因此，揭示心律失常發(fā)生的深層機(jī)制，尋找療效確切、無明顯不良反應(yīng)的抗心律失常藥物成為該研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。牛磺酸鎂配合物(taurine magnesium coordination compound，TMCC)是本研究室合成的配合物，既往實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)該配合物對多種因素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性心律失常與觸發(fā)活動有確切的防治效果［4-6］，且其對缺血/再灌注心律失常的治療效果明顯優(yōu)于單用牛磺酸或鎂離子。細(xì)胞水平的研究證明該配合物不僅對正常狀態(tài)的鈉、鉀、鈣離子通道有影響［7-8］，而且對藥物誘發(fā)的異常鈉電流及異常鈣電流亦有作用［9-11］。提示該配合物可能具有廣泛的抗心律失常作用，但作用機(jī)制尚未被充分闡明。內(nèi)向整流鉀通道Ik1的異常與心律失常的關(guān)系深入研究的報(bào)道甚少，鑒于Ik1通道特殊的結(jié)構(gòu)和電生理特性，有學(xué)者認(rèn)為Ik1通道與抗心律失常的關(guān)系研究意義重大［12］。諸多疾病或病理情況下發(fā)生的心律失常與Ik1下降有關(guān)，如LQT綜合征、尖端扭轉(zhuǎn)性室速、心肌缺血性心律失常等。但未見有報(bào)道TMCC對Ik1作用的相關(guān)文獻(xiàn)，因此，本研究擬建立大鼠心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧模型，觀察TMCC對大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀通道的影響，探討其抗心律失常的電生理及離子通道機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量220～250 g，合格證號:SCXK(軍)2009-003。

1.1.2 藥品與試劑 HEPES、EGTA、Mg-ATP、膠原酶Ⅱ等購自Sigma公司。TMCC由天津醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室合成。

1.1.3 儀器 膜片鉗儀，MultiClamp 700B，USA;數(shù)-模轉(zhuǎn)換器，DigiData1440A，USA;倒置顯微鏡，IX51，Japan;三維操縱儀，MP-225，USA;微電極拉制儀，P-97，USA;恒流泵，Peri-Star，臺灣;酸度計(jì)，PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司;Millipore純水系統(tǒng)，USA。

1.1.4 液體的制備 無鈣臺式液(mmol·L-1): NaCl 136，KCl 5.4，NaH2PO40.33，MgCl21.0，HEPES 10，Glucose 10;用NaOH調(diào)pH至7.45。細(xì)胞保存液(KB液，mmol·L-1):L-谷氨酸70，?；撬?5，KCl 30，KH2PO410，MgCl20.5，HEPES 10，EGTA 0.5，Glucose 10;用KOH調(diào)pH至7.4。記錄內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)的細(xì)胞外液(mmol·L-1): NaCl 132，CaCl21.8，KC1 4，MgCl21.2，HEPES 10，Glucose 10，CdC120.1;用NaOH調(diào)pH至7.4。記錄內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)的缺氧細(xì)胞外液:去除Glucose，其余同記錄內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)的細(xì)胞外液，通氮?dú)?0 min，用NaOH調(diào)pH到6.80。記錄Ik1的電極內(nèi)液(mmol·L-1):KCl 140，MgCl21，MgATP 4，EGTA 5，HEPES 10;用KOH調(diào)pH至7.3。

1.2 方法

1.2.1 單個(gè)大鼠心肌細(xì)胞的分離 用25%烏拉坦將大鼠麻醉，仰位固定于鼠臺上，迅速剪開胸腔暴露心臟，從主動脈根部離斷取出心臟放入4℃無鈣臺式液中，去除脂肪及結(jié)締組織。將主動脈逆行插管連接于Langendorff灌流裝置(恒溫37℃)上，以無鈣臺式液8 ml·min-1連續(xù)灌流5 min，洗去心臟殘血后改用50 ml含10mg膠原酶Ⅱ與15 mg牛血清白蛋白的無鈣臺式液進(jìn)行循環(huán)灌流。隨著灌流的進(jìn)行，流出液變得黏稠，心肌的顏色逐漸變淺、透明，心臟體積逐漸變大、松軟。此時(shí)將心臟自左心室分段剪取心肌組織，置于裝有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打使之分散成單個(gè)細(xì)胞，分裝，置4℃冰箱中穩(wěn)定2 h待用。

1.2.2 內(nèi)向整流鉀通道電流(Ik1)的記錄 應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞離子電流。所用微電極用兩步拉制儀拉制而成，微電極充電極液后電阻在2～4 MΩ之間。電流信號經(jīng)MultiClamp 700B膜片鉗 放 大 器、DigiData1440A 數(shù)-模 轉(zhuǎn) 換 器 及Pclamp10.1采集儲存及分析。將細(xì)胞懸液置于倒置顯微鏡工作平臺容積為1 ml的浴槽中，待細(xì)胞貼壁后，用鉀外液進(jìn)行灌流，流速1 ml·min-1。選用大小相近、紋理清晰的桿狀細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待高阻封接后，進(jìn)行電極電容補(bǔ)償。負(fù)壓或高電壓脈沖破膜，進(jìn)行膜電容、串聯(lián)電阻及漏電流補(bǔ)償，平衡5 min，待電極內(nèi)鉀內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液交換充分后，進(jìn)行膜電流記錄。膜電流的大小以電流密度及單位膜電容的膜電流表示。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組和造模 實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、正常+100 μmol·L-1TMCC組、正常+200 μmol· L-1TMCC組、正常+400 μmol·L-1TMCC組、缺氧/復(fù)氧模型組(H/R組)、H/R+24.24 μmol·L-1胺碘酮組、H/R+100 μmol·L-1TMCC組、H/R+ 200 μmol·L-1TMCC組、H/R+400 μmol·L-1TMCC組。將分離的細(xì)胞置于浴槽中，待貼壁后，先用記錄內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)的細(xì)胞外液進(jìn)行灌流，封接形成全細(xì)胞記錄模式后，平衡5 min，待電極內(nèi)鉀內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液充分交換后，進(jìn)行膜電流記錄，定義為正常細(xì)胞Ik1，正常+TMCC組即在以上條件下加入不同濃度的TMCC進(jìn)行記錄;然后用缺氧鉀外液沖洗替換浴槽中的正常鉀外液，15 min后再以正常有氧鉀外液沖洗替換缺氧鉀外液，5 min后記錄即為缺氧/復(fù)氧組Ik1;H/R+TMCC組和H/R+胺碘酮組分別在有氧鉀外液中加入不同濃度的TMCC和胺碘酮。記錄Ik1時(shí)細(xì)胞外液中加入CdCl2以阻斷L-鈣電流。形成全細(xì)胞構(gòu)型后，在電壓鉗模式下記錄電流。保持電壓為-50 mV，指令電壓從-100 mV開始，以10 mV步階躍至 -10 mV，脈沖持續(xù)300 ms，刺激頻率為0.2 Hz，可記錄到大鼠心肌細(xì)胞的Ik1電流。在細(xì)胞外液中加入0.l mmol·L-1CdCl2使鈣通道電流失活，鉗制電壓-50 mV以阻斷INa的影響。測定從0時(shí)開始到刺激結(jié)束時(shí)的300 ms電流穩(wěn)態(tài)值，除以該細(xì)胞的電容標(biāo)化為Ik1的電流密度(pA·pF-1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在Clampfit 10.0軟件中將記錄的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，結(jié)果以±s表示。根據(jù)給藥前后不同電壓水平下的最大激活電流繪制Ik1的I-V曲線。采用SPSS 17.0軟件對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析給藥組與對照組間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 TMCC對正常大鼠心肌細(xì)胞Ik1的影響 記錄Ik1電流，保持電壓為-50 mV，指令電壓從-100 mV開始，以10 mV步階躍至 -10 mV，脈沖持續(xù)300 ms，刺激頻率為0.2 Hz，可記錄到大鼠心肌細(xì)胞的Ik1電流(Fig 1)。在細(xì)胞外液中加入0.1 mmol· L-1CdCl2使鈣通道電流失活，鉗制電壓-50 mV以阻斷INa的影響。測定從0時(shí)開始到刺激結(jié)束時(shí)的300 ms電流穩(wěn)態(tài)值，Ik1電流為電流峰值與基線之差，除以該細(xì)胞的電容標(biāo)化為Ik1的電流密度(pA· pF-1)。Ik1內(nèi)向電流以刺激電壓-100 mV峰值電流密度作為觀察指標(biāo)，Ik1內(nèi)向電流以刺激電壓-30 mV峰值電流密度作為觀察指標(biāo)。正常對照組和各濃度TMCC對正常細(xì)胞作用的Ik1電流峰值及I-U曲線變化見Tab 1，F(xiàn)ig 2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常組細(xì)胞的Ik1內(nèi)向及外向電流峰值與正常+TMCC(100、200、400 μmol·L-1)組相比，差異無顯著性(P均 ＞0.05);I-V曲線無明顯變化。不同濃度TMCC對正常大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀通道電流沒有作用。

Fig 1 Current of Ik1in rat ventricular myocardiocytes

Tab 1 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1) on Ik1current density in normal rat ventricular myocardiocytes(±s，n=6)

Tab 1 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1) on Ik1current density in normal rat ventricular myocardiocytes(±s，n=6)

Group Inward current density/pA·pF-1 (-100 mV) Outward current density/pA·pF-1 (-30 mV) Normal -13.05±1.43 2.43±0.32 Normal+100μmol·L-1TMCC -12.98±1.09 2.26±0.23 Normal+200μmol·L-1TMCC -12.77±1.11 2.33±0.55 Normal+400μmol·L-1TMCC -12.71±1.16 2.44±0.21

Fig 2 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1)on I-U curves of Ik1in normal rat ventricular myocardiocytes(n=6)

2.2 TMCC和胺碘酮對大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型Ik1的影響 記錄Ik1電流，保持電壓為-50 mV，指令電壓從-100 mV開始，以10 mV步階躍至-10 mV，脈沖持續(xù)300 ms，刺激頻率為0.2 Hz，可記錄到大鼠心肌細(xì)胞的Ik1。在細(xì)胞外液中加入0.l mmol·L-1CdCl2可使鈣通道電流失活，鉗制電壓-50 mV以阻斷INa的影響。測定從0時(shí)開始到刺激結(jié)束時(shí)的300 ms電流穩(wěn)態(tài)值，Ik1電流為電流峰值與基線之差，除以該細(xì)胞的電容標(biāo)化為Ik1的電流密度(pA·pF-1)。Ik1內(nèi)向電流以刺激電壓-100 mV峰值電流密度作為觀察指標(biāo)，Ik1內(nèi)向電流以刺激電壓-30 mV峰值電流密度作為觀察指標(biāo)。胺碘酮及各濃度TMCC對正常細(xì)胞作用的Ik1電流峰值及I-V曲線變化見Tab 2，F(xiàn)ig 3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧/復(fù)氧能使Ik1內(nèi)向電流峰值從(-13.05±1.43)pA·pF-1降至(-6.94±0.59)pA·pF-1(n=6，P＜0.01)，內(nèi)向電流曲線上移，使Ik1外向電流峰值從(2.43± 0.32)pA·pF-1降到(1.31±0.28)pA·pF-1，外向電流曲線下移。提示缺氧/復(fù)氧損傷引起大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀通道異常，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽涑晒?。與缺氧/復(fù)氧組相比，TMCC(100、200、400 μmol· L-1)可使減小的內(nèi)向電流峰值分別恢復(fù)為(-7.21 ±0.79)pA·pF-1、(-7.28±0.22)pA·pF-1、(-10.96±0.78)pA·pF-1(n=6，P＜0.01)，24.24 μmol·L-1胺碘酮使其恢復(fù)為(-8.80±0.97)pA· pF-1。TMCC(100、200、400 μmol·L-1)和胺碘酮均可使上移的內(nèi)向電流曲線下移。使減小的外向電流分別恢復(fù)為(0.90±0.14)pA·pF-1、(1.84± 0.46)pA·pF-1、(2.36±0.40)pA·pF-1，24.24 μmol·L-1胺碘酮使其恢復(fù)為(2.16±0.69)pA· pF-1，TMCC(100、200、400 μmol·L-1)和胺碘酮均可使下移的外向電流曲線上移。翻轉(zhuǎn)電位均在-50 mV到-60 mV之間，無明顯變化。

Tab 2 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1)，amiodarone(24.24 μmol·L－1)on Ik1current density in rat ventricular cardiomyocytes suffered from hypoxia/ reoxygenation(H/R)(±s，n=6)

Tab 2 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1)，amiodarone(24.24 μmol·L－1)on Ik1current density in rat ventricular cardiomyocytes suffered from hypoxia/ reoxygenation(H/R)(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal;##P＜0.01 vs H/R;▲P＜0.05▲▲P＜0.01 vs amiodarone;★★P＜0.01 vs 100 μmol·L-1TMCC;▼▼P＜0.01 vs 200 μmol·L-1TMCC

Group Inward current density /pA·pF-1 (-100 mV) Outward current density /pA·pF-1 (-30 mV) Normal -13.05±1.43 2.43±0.32 H/R -6.94±0.59 1.31±0.28 H/R+24.24μmol·L-1 amiodarone -8.80±0.97＊＊## 2.16±0.69## H/R+100μmol·L-1TMCC -7.21±0.79＊＊▲ 0.90±0.14＊＊▲▲H/R+200μmol·L-1TMCC -7.28±0.22＊＊▲ 1.84±0.46★★H/R+400μmol·L-1 TMCC -10.96±0.78＊＊##▲▲★★▼▼ 2.36±0.40##★★

Fig 3 Effects of TMCC(100，200，400 μmol·L－1)and amiodarone(24.24 μmol·L－1)on I-V curves of Ik1 in normal rat ventricular myocardiocytes suffered from hypoxia/reoxygenation(H/R)(n=6)

3 討論

內(nèi)向整流鉀通道(inward rectifier potassium channel)于1949年由Katz首先在鉀去極化肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其為一大類鉀離子通道，在各種組織中廣泛分布，其中心肌細(xì)胞中主要有 Kir2.1、Kir2.2、Kir2.3，心臟中的內(nèi)向整流鉀通道主要分布在心房肌和心室肌，其在心肌細(xì)胞動作電位的各時(shí)相均有開放，但在動作電位3相復(fù)極和靜息電位相電導(dǎo)性最大。其在超極化時(shí)表現(xiàn)為明顯的內(nèi)向電流，鉀離子大量內(nèi)流，膜電位靠近鉀的平衡電位，防止過度超極化［13］，輕度去極化時(shí)表現(xiàn)為外向電流，借此維持靜息電位的穩(wěn)定。當(dāng)進(jìn)一步去極化時(shí)外向電流反而減小，表現(xiàn)出內(nèi)向整流特性［14］，主要功能是參與動作電位的3期復(fù)極，維持心肌細(xì)胞靜息電位的正常水平和正常興奮節(jié)律。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，Ik1參與了許多病理性心律失常。Junichiro等［15］在Kir2.1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到多種心律失常，如緩慢心率、室性早搏、房室傳導(dǎo)阻滯和心房顫動(AF)等;相反地，kir2.1抑制性突變體表達(dá)的小鼠則表現(xiàn)為Ik1電流的抑制，靜息膜電位正向移動，動作電位時(shí)程延長，以及心肌興奮性變化如QRS波及QT間期的延長。心肌缺血和心肌梗死時(shí)心律失常發(fā)生也與Ik1下降有關(guān)。Almond等［16］報(bào)道，大鼠心肌梗死區(qū)Ik1減小20%。Adeniran等［17］指出Ik1通道異常會引起伴有Andersen’s綜合征、LQT綜合征、SQTS等的心律失常。

本實(shí)驗(yàn)中的缺氧/復(fù)氧模型旨在模擬心肌細(xì)胞的缺血/再灌注過程，有研究表明組織缺血缺氧時(shí)，無氧代謝增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積，pH值降低，細(xì)胞外的鉀離子濃度升高［18］。再灌注時(shí)，發(fā)生鈉-鈣離子交換，細(xì)胞內(nèi)鈣超載的同時(shí)，細(xì)胞外的鈉離子濃度升高，產(chǎn)生大量自由基，進(jìn)而引起線粒體和細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)的損傷，造成心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。Ik1的整流作用減弱，或誘發(fā)早期后除極電位，而形成異常心律［19］。另有研究發(fā)現(xiàn)肥厚型心肌病及心力衰竭時(shí)心肌的Ik1電流密度減小，線粒體功能障礙會導(dǎo)致細(xì)胞的pH下降及Kir2.1電流的pH依賴性的上調(diào)，從而導(dǎo)致Ik1電流的抑制，部分解釋缺血缺氧時(shí)心肌的興奮性異常［20］。這與本實(shí)驗(yàn)Ik1電流變化相符。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺氧/復(fù)氧過程可使大鼠心肌細(xì)胞Ik1內(nèi)向電流和外向電流峰值均減小，動作電位時(shí)程增大，復(fù)極緩慢，靜息電位減少，復(fù)極異常和早后除極改變細(xì)胞興奮性易引起心律失常。TMCC可恢復(fù)Ik1電流異常，從而抑制因缺氧/復(fù)氧誘發(fā)的Ik1電流變化，使其恢復(fù)至正常水平，其作用與胺碘酮相當(dāng)。這一結(jié)果提示，TMCC對缺氧/復(fù)氧造成的快速性心律失常有治療作用。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中TMCC(100、200、400 μmol·L-1)對正常心肌細(xì)胞Ik1無影響，但可部分恢復(fù)缺氧/復(fù)氧減小的Ik1值，表明TMCC對心肌細(xì)胞Ik1的作用與該通道的狀態(tài)有關(guān)，可使異常的電流趨向恢復(fù)正常。TMCC對正常Ik1無明顯影響，提示該化合物不易出現(xiàn)因?qū)蝹€(gè)通道作用過強(qiáng)而導(dǎo)致心律失常等副作用。

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