來自鏈霉菌屬的阿魏酸酯酶的分離純化、理化性質(zhì)

范韻敏

來自鏈霉菌屬的阿魏酸酯酶的分離純化、理化性質(zhì)

范韻敏

（漳州職業(yè)技術(shù)學院, 福建 漳州 363000）

通過鹽析透析、離子層析、疏水層析，對鏈霉菌屬發(fā)酵液中的阿魏酸酯酶（FAE）進行分離純化，并進行酶學性質(zhì)研究。得出的阿魏酸酯酶的純化倍數(shù)為2.67，回收率為55.8%，酶分子約為30 kDa。其最適反應pH約為6.0，最適溫度約為50°C，金屬離子Cu2+和Zn2+對阿魏酸酯酶酶活力均有明顯的抑制作用，而Mg2+、Fe2+、Ca2+、Na+和Mn2+對酶的活性均有一定的促進作用。

阿魏酸酯酶；純化；性質(zhì)

阿魏酸酯酶[1]（E.C.3.1.1.73，F(xiàn)erulie acid esterases，F(xiàn)AE），屬于羧酸酯酶類，是一種典型的肉桂酸酯酶。它可破壞阿魏酸與多糖相連的酯鍵，從植物細胞壁中釋放阿魏酸，讓余下的多糖主鏈易被降解，有效提高了含有大量木質(zhì)纖維素和阿魏酸的副產(chǎn)品的營養(yǎng)價值[2]。阿魏酸酯酶的活性是在橄欖產(chǎn)色鏈霉菌和裂褐菌的發(fā)酵液中第一次被發(fā)現(xiàn)[3]。此后，幾種微生物被證實能分泌阿魏酸酯酶，以真菌為多，細菌與放線菌較少。但不同微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、理化性質(zhì)和催化功能上有所不同[4,5]。

研究對一鏈霉菌屬發(fā)酵的阿魏酸酯酶的分離純化，考察了其最適反應pH、最適溫度，以及金屬離子對其的影響，為木質(zhì)纖維綜合利用提供了前期的研究參考。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器

反式阿魏酸標準品，EDTA，阿魏酸甲酯(MFA)，硫酸銨，過硫酸銨，低分子量SDS蛋白Marker，考馬斯亮藍，DEAE-Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)，Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow層析介質(zhì)， AKTA Prime蛋白質(zhì)純化儀，蛋白電泳儀， Agilent 1100高效液相色譜儀，Thermo EC120小型垂直電泳系統(tǒng)，ODS-C18色譜柱(5μm，4.6 mm×250 mm)，Gis-2008凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.2菌種：從土壤中篩選得到的鏈霉菌屬

1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

（1）斜面培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基，pH 7.2-7.4，28°C培養(yǎng)72 h。

（2）液體種子培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基，不加瓊脂，pH自然。培養(yǎng)條件：250 mL三角瓶內(nèi)裝50 mL液體培養(yǎng)基，28°C，200 rpm培養(yǎng)72 h。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（%）[6]：KH2PO40.30、Na2HPO4·7H2O 0.60、NaCl 0.01、酵母粉0.80、麥糟1.33（粒徑<0.054mm）。培養(yǎng)條件：250 mL三角瓶內(nèi)裝75 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C，210 rpm培養(yǎng)68 h。

1.3阿魏酸和阿魏酸酯酶酶活測定

1.3.1阿魏酸的測定

采用HPLC法[7]。流動相為甲醇：水：冰醋酸=30 : 69.5 : 0.5(v:v:v)；流速為0.8 mL/min；柱溫30°C；檢測波長318 nm；ODS-C18柱；進樣量為20 μL；檢測器為紫外檢測器，進行等梯度洗脫。

1.3.2阿魏酸酯酶酶活測定[8]

發(fā)酵液離心后取250 μL上清液加入250 μL阿魏酸甲酯溶液，50°C保溫15 min后加500 μL的冰乙酸（10% v/v），離心，4°C保存?？瞻讟悠窞橹蠓惺Щ畹陌l(fā)酵上清液，處理方法同上。用HPLC法測定其阿魏酸含量。根據(jù)公式：酶活力（U/mL）=W×Df×1000 / 194.18×15×0.25，從而算出阿魏酸酯酶酶活力。式中，W：酶解反應產(chǎn)生的阿魏酸量（mg）；Df：稀釋度；1000：將mmol轉(zhuǎn)化成μmol所乘的系數(shù)；194.18：阿魏酸的分子量（mg/mmol）；15：反應時間（min）；0.25：與底物反應的待測酶液量。

1.4蛋白質(zhì)標準曲線的繪制

蛋白質(zhì)標準曲線的繪制采用考馬斯亮藍法[9]。

1.5鹽析曲線的繪制

根據(jù)硫酸銨飽和度，稱取相應重量的固體硫酸銨，加入發(fā)酵上清液，使其飽和度分別為40%、45%……95%、100%，4°C靜置24 h后離心，棄上清，加10 mL pH 6.0，Na2HPO4-C6H8O7緩沖液。分別測定各個硫酸銨飽和度的沉淀的酶活力。將未經(jīng)硫酸銨處理過的原始酶液的總酶活定為100%。沉淀的酶活力與總酶活的比值定義為相對酶活，繪制鹽析曲線圖。確定最佳硫酸銨飽和度。

1.6 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析原理

平衡緩沖液：pH 6.0，0 M NaCl，Na2HPO4-C6H8O7緩沖液。洗脫緩沖液：pH 6.0，1 M NaCl，Na2HPO4-C6H8O7緩沖液。用平衡緩沖液平衡DEAE-Sepharose Fast Flow柱，流速為5 mL/min。上樣量為2 mL。后用洗脫緩沖液進行洗脫，洗脫流速為5 mL/min，采用部分收集器連續(xù)收集洗脫液，用于測定酶活，以確定最適的洗脫梯度。

1.7 Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水層析

平衡緩沖液：pH 6.0，40% 的飽和(NH4)2SO4，Na2HPO4-C6H8O7緩沖液。洗脫緩沖液：pH 6.0，Na2HPO4-C6H8O7緩沖液。用平衡緩沖液平衡Phenyl FF柱后上樣，流速為1 mL/min。上樣量為2 mL。后用洗脫緩沖液進行洗脫，洗脫流速為1 mL/min。采用部分收集器連續(xù)收集洗脫液，用于酶活測定。以確定最適的洗脫梯度。

1.8 SDS-PAGE 蛋白電泳

本實驗用10%分離膠及5%濃縮膠制膠。樣品加等體積的2×上樣緩沖液，沸水浴5 min，瞬時離心。上樣量為10-15 μL，采用15 V/cm的電壓進行電泳，采用考馬斯亮藍進行染色1-2 h，SDS聚丙烯酰胺凝膠進行脫色3 h以上，后用GIS-2008凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.9阿魏酸酯酶酶學性質(zhì)研究

1.9.1最適反應pH值和pH值穩(wěn)定性的測定

最適反應pH值的測定：在50°C，不同的pH值條件下分別測定酶活，以酶活最高為100%，計算相對酶活。所用緩沖液是0.2 M，pH 4.0-9.0的Na2HPO4-C6H8O7緩沖液。

pH值穩(wěn)定性的測定：將酶液置于不同pH值的0.2 M，pH 4.0-9.0的Na2HPO4-C6H8O7緩沖液中，在50°C保溫，測定殘留酶活性，以各pH值的初始酶活為100%，計算百分比。

1.9.2最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性的測定

最適反應溫度的測定：在酶液中加入等體積的MFA，在25°C -60°C范圍內(nèi)，隨時間變化每隔5°C，測定酶活。以該溫度初始酶活為100%，計算相對酶活。所用緩沖液是0.2 M，pH 4.0-9.0的Na2HPO4-C6H8O7緩沖液。

溫度穩(wěn)定性的測定：在0.2 M，pH 6.0的Na2HPO4-C6H8O7緩沖溶液中，分別將酶液置于 25°C、30°C……60°C下保溫8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，分別測定酶活，以初始酶活為100%，測定酶的溫度穩(wěn)定性。

1.9.3金屬離子對酶活力的影響

將酶液置于不同離子的反應液中（離子濃度為10 mmol/L），靜置過夜。反應液中還含有0.2 M，pH 6.0的Na2HPO4-C6H8O7緩沖溶液。以不添加離子的酶樣活性為100%，考察金屬離子對酶活力的影響。

2 實驗結(jié)果

2.1蛋白標準曲線的制作

蛋白標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白質(zhì)濃度標準曲線

圖2 鹽析曲線

2.2鹽析曲線的制作

鹽析曲線如圖2，隨著硫酸銨飽和度增大，沉淀中的相對酶活力緩慢增多，表明蛋白質(zhì)逐步被沉淀，這和硫酸銨鹽析的理論一致。當硫酸銨飽和度低于40%時，大部分蛋白酶仍保留在溶液中，相對酶活力較低。而當硫酸銨飽和度至80%，相對酶活力達到最大，大約90%的蛋白酶已經(jīng)被沉淀。當硫酸銨飽和度超過80%時，部分蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)析出量減少，相對酶活力急劇下降?？梢娏蛩徜@最適鹽析飽和度為80 %。

2.3離子交換層析

經(jīng)采用不同梯度的緩沖液進行洗脫，確定40%至100%洗脫緩沖液二級洗脫，分離效果最佳。粗酶液經(jīng)DEAE FF離子交換層析，得到穿透峰和兩個洗脫峰，其酶活力如表1所示，所得活力組分主要集中在未吸附的穿透峰，洗脫峰中只有很小的酶活力。將收集到的穿透峰的層析液冷凍干燥濃縮后進行蛋白電泳，考察其分離效果（圖3）?？芍置敢旱玫讲糠旨兓勺畛醯?條條帶純化至3條條帶。收集該酶活力組分，為1 mL Phenyl FF(high sub)疏水層析樣品。

表1 離子層析穿透峰和洗脫峰的酶活力

表2 疏水層析穿透峰和洗脫峰的酶活力

2.4疏水層析

經(jīng)采用不同梯度的緩沖液進行洗脫，確定100%洗脫緩沖液梯度洗脫，達到最佳的分離效果。將DEAE FF離子交換層析后得到的穿透峰樣品，進行Phenyl FF疏水層析，得到穿透峰和洗脫峰兩個峰，其酶活力如表2所示，所得活力組分主要集中在洗脫峰，穿透峰中只有很小的酶活力。將收集到的洗脫峰的層析液冷凍干燥濃縮后進行蛋白電泳，考察其分離效果（圖3）。

2.5蛋白電泳檢驗純度

通過SDS-PAGE電泳檢驗得到的蛋白的純度，如圖3所示。圖上顯示所純化出來的阿魏酸酯酶的分子量約為30 kDa。從左至右，從泳道3、4可以判斷，除了目標蛋白外，沒有其他條帶，得到了電泳純的目標蛋白。從表3可以看出，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow純化后，酶的比活由11.2 U/mg提高到19.8 U/mg，純化倍數(shù)為1.77，回收率為81.5%。通過Phenyl-Sepharose Fast Flow純化，酶的比活達到29.9 U/mg，純化倍數(shù)為2.67，回收率為55.8%，較好的進行了酶的回收。

圖3 蛋白電泳圖：泳道1為上樣樣品(即粗酶液)，泳道2為DEAE穿透峰樣品，泳道3、4為Phenyl洗脫峰樣品，圖中泳道5代表蛋白Marker。

表3 阿魏酸酯酶的純化

2.6酶學性質(zhì)研究

2.6.1最適反應pH值和pH值穩(wěn)定性的測定

經(jīng)純化的阿魏酸酯酶在不同pH (4.0-9.0)下進行酶促反應以測定其最適 pH值，結(jié)果見圖4。純化的阿魏酸酯酶酶活隨著反應液pH值的變化而變化，在pH值較小時，酶活力較低，pH值為6.0時，阿魏酸酯酶酶活最大，隨著pH值的繼續(xù)增大，酶活力緩慢下降。

圖4 反應pH對阿魏酸酯酶活性的影響

圖5 pH對FAE穩(wěn)定性的影響

在pH 4.0-9.0范圍內(nèi)，考察了阿魏酸酯酶隨時間的pH值穩(wěn)定性，見圖5。結(jié)果表明在pH 4.0-6.0之間，酶保持了較高的穩(wěn)定性，其中pH=5.0的時候酶活穩(wěn)定性最高。pH值繼續(xù)增加，酶穩(wěn)定性下降。

2.6.2最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性的測定

最適溫度的測定是在pH 6.0、0.2 M的Na2HPO4-C6H8O7緩沖溶液體系下進行的酶促反應。結(jié)果如圖6所示，隨溫度升高阿魏酸酯酶的酶活力迅速增加，反應溫度50°C時，阿魏酸酯酶酶活力最大；當溫度超過55°C時酶活力緩慢下降。

圖6 反應溫度對FAE活性的影響

圖7 溫度對FAE穩(wěn)定性的影響

在25°C -60°C考察了阿魏酸酯酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖7。在25°C-35°C保溫120 h，阿魏酸酯酶酶相對活力在80%以上，具有較好的熱穩(wěn)定性。隨著溫度的增高，阿魏酸酯酶的熱穩(wěn)定性下降?？梢姲⑽核狨ッ冈跍囟容^低的情況下穩(wěn)定性較強，有利于保存。

2.6.3金屬離子對酶活力的影響

為確定金屬離子對酶活力的影響，在含有不同10 mmol×L-1一價、二價金屬離子的反應液中，考察金屬離子對酶活力的影響。以不添加金屬離子的酶活力為對照（100%），結(jié)果如表4。Cu2+、Zn2+對阿魏酸酯酶酶活力均有明顯的抑制作用，Cu2+尤其明顯。而Mg2+、Fe2+、對酶活力有一定的促進作用。其余離子對在檢測范圍對酶活沒有顯著影響。

表4 金屬離子對阿魏酸酯酶酶活力的影響

2.7與其他來源的阿魏酸酯酶比較

本實驗純化的阿魏酸酯酶（FAE-M）與國外的黑曲霉來源的阿魏酸酯酶的理化性質(zhì)進行比較（表5）[4,5]，發(fā)現(xiàn)實驗篩選出來的FAE-M與國外的黑曲霉來源FAE-II分子量較為接近，但最適pH差別較大；FAE-M與黑曲霉來源的FAE-III的最適溫度和最適pH較為接近，分子量也較為接近。說明所得到的FAE-M可能為一種新酶，仍需進一步研究加以確認。

表5 阿魏酸酯酶的理化性質(zhì)

3討論

在本實驗中，從菌種的麥糟發(fā)酵液中純化得到一個阿魏酸酯酶的組分，雖然阿魏酸酯酶純化的研究已有很多報道，但放線菌產(chǎn)阿魏酸酯酶報道較少。經(jīng)鹽析、透析、離子交換層析、疏水層析對阿魏酸酯酶進行分離純化，得到了電泳純的目標蛋白。SDS-PAGE電泳確定酶的分子量約為30 kDa。阿魏酸酯酶的純化倍數(shù)為2.67，回收率為55.8%。該酶最適反應pH約為6.0；在pH 4.0-6.0阿魏酸酯酶的穩(wěn)定性較高；其最適反應溫度約為50°C；在25°C-35°C保溫120 h后阿魏酸酯酶酶相對活力在80%以上，表明阿魏酸酯酶具有較好的熱穩(wěn)定性。金屬離子Cu2+和Zn2+對阿魏酸酯酶酶活力均有明顯的抑制作用，而 Mg2+、Fe2+對酶的活性均有一定的促進作用。

實驗純化的阿魏酸酯酶（FAE-M）與國外黑曲霉來源的阿魏酸酯酶的理化性質(zhì)進行比較，發(fā)現(xiàn)實驗篩選出來的FAE-M與國外的黑曲霉來源FAE-II分子量較為接近，但最適pH差別較大；FAE-M與黑曲霉來源的FAE-III的最適溫度和最適pH較為接近，分子量也較為接近。說明所得到的FAE-M可能為一種新酶，仍需進一步研究加以確認。

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Purification and characterization of ferulic acid esterase from Streptomyces

FAN Yun-min

（Zhangzhou Institute of Technology, Fujian Zhanghzou, 363000）

Ferulic acid esterase produced from the strain was purified by salted out, dialyzed, DEAE-sepharose, Phenyl-sepharose, enzyme specific activity was increased from 11.2 U/mg to 29.9 U/mg and activity recovery reached 55.8%. The molecular mass of this enzyme was estimated to be 30kDa by 0.8% SDS-PAGE. The ferulic acid esterase had an optimal pH value 6.0, and it was stable at pH value 4.0-6.0. Optimal (reaction) temperature of the ferulic acid esterase was 50 ℃, and it was very stable in 25°C-35°C. Metal ions Cu2+, Zn2+had negative effect on FAE, but Mg2+, Fe2+, Ca2+, Na+, Mn2+have promotion effect on FAE.

ferulic acid esterase, purification, physicochemical properties

（責任編輯：季平）

2012－04－15

范韻敏（1984－），女，福建漳州人，助教，工學碩士。

TQ925

A

1673-1417（2012）02-0020-06