王清酈，孫啟忠，趙淑芬，郭艷艷，周國棟

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.林西縣草原工作站，內(nèi)蒙古 林西 025025； 4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

尖葉胡枝子(Lespedezahedysaroides)為中旱生草本小半灌木，在森林和森林草原帶的草甸草原群落中為優(yōu)勢種或伴生種，或為草原帶的山地灌叢伴生成分，常見于草甸草原帶的丘陵坡地、沙質(zhì)地上或林緣[1-2]。尖葉胡枝子具有抗旱、耐寒、耐瘠薄及適應(yīng)性廣等特性，是荒地造林、水土保持和土壤改良的先鋒植物，并且具有返青早、枯黃晚、葉量大、花期長、泌蜜量大、營養(yǎng)價值高、再生能力強、適口性好等特點，可用作飼料、薪炭林、蜜源植物和藥用植物[3-5]。

種子貯藏蛋白(Seed Storage Proteins，SSP)，是指高等植物在種子成熟過程中合成并大量貯存的貯藏蛋白質(zhì)，為植物的生長發(fā)育提供重要的碳源、氮源和硫源。貯藏蛋白質(zhì)占種子總蛋白含量的60%～80%，豆科植物中總蛋白含量較高，已成為人類除肉類外重要的蛋白質(zhì)來源[6-8]。種子貯藏蛋白根據(jù)溶解特性可分為四大類，即溶于水的清蛋白、鹽溶蛋白(包括白蛋白和球蛋白)、醇溶蛋白和溶于稀酸或稀堿溶液的谷蛋白。蛋白的組成由基因決定、幾乎不受外界環(huán)境的影響，蛋白組分的差異可以反映出基因型的不同，因此，種子貯藏蛋白也被稱為生化“指紋”[9]。研究種子貯藏蛋白的方法有多種，蛋白質(zhì)電泳譜帶具有較高的多態(tài)性、專一性和穩(wěn)定性，在植物的生化水平遺傳多樣性研究、品種鑒定、種群或居群間的遺傳變異以及遺傳結(jié)構(gòu)的研究等方面得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)因其多種優(yōu)良特性而得到研究者的青睞，如電泳速度只與分子量大小有關(guān)、電泳結(jié)果穩(wěn)定、不受貯藏年限和外界環(huán)境影響等[12-13]。本試驗采用SDS-PAGE電泳技術(shù)對3個不同類型尖葉胡枝子的種子貯藏蛋白進(jìn)行比較研究，從生化水平上探討尖葉胡枝子的遺傳多樣性，從而了解胡枝子屬的遺傳背景，以期為胡枝子屬種質(zhì)資源的研究和合理開發(fā)利用提供方法依據(jù)[14]。

1 材料與方法

1.1試驗區(qū)自然概況 試驗地設(shè)在赤峰市林西縣城北5 km處的農(nóng)研場。海拔900 m，屬于半干旱大陸性季風(fēng)氣候；年均氣溫4～5 ℃，7月最熱，平均氣溫20～22 ℃，極端最高氣溫40.4 ℃，1月最冷，平均氣溫-17～-13 ℃，極端最低氣溫-32.2 ℃，≥10 ℃積溫2 600 ℃·d，年均日照時數(shù)2 985.9 h；年均降水量320～380 mm，降水主要集中在6-8月，占全年的76.7%，年蒸發(fā)量1 800 mm以上，是降水量的4.95倍；無霜期125～130 d；土壤為栗鈣土。

1.2試驗材料 供試材料為尖葉胡枝子，有3個不同類型，其中一個類型是已經(jīng)通過審查登記的品種科爾沁尖葉胡枝子，另外2個類型是在科爾沁尖葉胡枝子多年的栽培過程中發(fā)現(xiàn)的具有穩(wěn)定遺傳的種群分化類型。以科爾沁尖葉胡枝子自命名為普通型，其他兩種根據(jù)形態(tài)特性自命名為濃綠型和高桿型。于2008年6月3日播種，播種量為6.0 kg·hm-2。行距45 cm，開溝溜種，覆土1.5～2.0 cm。苗期除草2次，播種當(dāng)年澆凍水，第2年返青后除草2遍。

1.3試驗方法 采用SDS-PAGE垂直平板電泳方法，具體操作參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》[15]。分別對各類種子貯藏蛋白(清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和鹽溶蛋白)及總貯藏蛋白進(jìn)行電泳分析。

1.3.1種子貯藏蛋白的提取 不同溶劑的蛋白質(zhì)提取液配方及用量：①清蛋白提取液：去離子水，提取用量350 μL；②鹽溶蛋白提取液：0.25 mmol·L-1Na3PO4、2 mol·L-1NaCl，pH值7.0，提取用量350 μL；③醇溶蛋白提取液：75%乙醇溶液，提取用量350 μL；④谷蛋白提取液：0.2%NaOH溶液，提取用量350 μL；⑤貯藏蛋白提取液：5 mL 10%SDS，1.5 mL 2-ME，1.25 g溴酚蘭，3.44 mL甘油，2.0 mL 1 mol·L-1Tris-HCl，pH值 6.8，加雙蒸水定容到25 mL，提取用量350 μL。

取20粒種子洗凈擦干，放入研缽中研碎，置于1.5 mL離心管中，加入上述配置的蛋白提取液[16-18][其中鹽溶蛋白在加提取液之前需要進(jìn)行前處理：在加有研碎種子的離心管中加入200 μL脫脂劑(氯仿∶甲醇∶丙酮=2∶1∶1)，振蕩混勻，常溫下脫脂2 h，10 000 r·min-1離心10 min，棄上清后備用，待加鹽溶蛋白提取液]。室溫振蕩浸提2 h，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱備用。以1∶1的比例加入上樣緩沖液，煮沸5 min后點樣。

1.3.2SDS-PAGE電泳 SDS-PAGE的濃縮膠濃度3%，分離膠濃度12%。各類貯藏蛋白及總的貯藏蛋白的上樣量15 μL，標(biāo)準(zhǔn)蛋白D532S(分子量6.5～200 kDa)，上樣量5 μL，用北京六一電泳儀器廠生產(chǎn)的DYZ-28B型電泳槽，濃縮時電壓恒壓200 V，分離時電流恒流60 mA電泳，室溫下電泳約7 h，至指示劑跑到距底部1 cm處，電泳結(jié)束后剝下膠片，染色3～10 h，脫色至條帶清晰為止，照相并進(jìn)行統(tǒng)計[18]。

1.4統(tǒng)計分析 根據(jù)SDS-PAGE電泳的特點，蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)，單體電泳遷移率與蛋白單體分子量的關(guān)系為：

lgMW=K1-bm

式中，MW為蛋白單體分子量，m為蛋白單體遷移率，K1和b為常數(shù)。

蛋白質(zhì)相對遷移率(Rf)=

通過已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Protein Marker)在相同電泳條件下的遷移率，繪制出分子量與遷移率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算供試材料的蛋白單體遷移率和分子量。對清晰蛋白質(zhì)條帶的有無進(jìn)行標(biāo)記，有為1，無為0，得出(0，1)矩陣。利用Popgene 1.31軟件進(jìn)行Nei’s遺傳距離(D)和遺傳一致度(I)分析。利用NTSYS-pc 2.1系統(tǒng)進(jìn)行聚類分析[19]。通過SAS軟件對不同提取液做差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

利用SDS-PAGE電泳技術(shù)對3個不同類型的尖葉胡枝子種子貯藏蛋白進(jìn)行電泳，獲得清晰穩(wěn)定的遺傳蛋白圖譜(圖1)。

圖1 3個不同類型尖葉胡枝子的蛋白電泳圖譜Fig.1 Electrophoregrams of seed storage proteins of three Lespedeza hedysaroides

2.1清蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白電泳結(jié)果 經(jīng)電泳染色、脫色后，點樣孔加入清蛋白和谷蛋白的泳道無清晰譜帶出現(xiàn)，點樣孔加入醇溶蛋白的泳道中出現(xiàn)幾條痕跡很淺的條帶。

2.2鹽溶蛋白譜帶遺傳多樣性分析 3份供試材料的鹽溶蛋白質(zhì)譜帶存在差異，共檢測出19條蛋白譜帶，其中6條譜帶為穩(wěn)定表達(dá)譜帶，表達(dá)率為100%；其余13條為不同程度表達(dá)的多態(tài)性譜帶，多態(tài)性數(shù)目占總條帶的68.42%。把整個蛋白譜帶劃分為4個區(qū)域：α區(qū)、β區(qū)、γ區(qū)和ω區(qū)，其中α區(qū)相對遷移率為0.7～1.0，β區(qū)相對遷移率為0.3～0.7，γ區(qū)相對遷移率為0.1～0.3，ω區(qū)相對遷移率為0～0.1。鹽溶蛋白的各區(qū)域均有條帶出現(xiàn)，其中α區(qū)有4條，β區(qū)有6條,γ區(qū)有6條，ω區(qū)有3條，分子量大小13.57～154.53 KDa(表1)。

計算3個不同類型尖葉胡枝子鹽溶蛋白的Nei’s的遺傳距離和遺傳一致度(表2)，普通型與濃綠型的遺傳距離最小,為0.021 3;普通型與高桿型的遺傳距離最大，為1.035 5。高桿型與普通型的遺傳一致度最小，為0.355 1，濃綠型與普通型的遺傳一致度最大，為0.978 9。

表1 3個不同類型尖葉胡枝子鹽溶蛋白電泳出現(xiàn)頻率和蛋白分子量Table 1 Frequency of bands and molecular weight of salt-soluble protein of three L. hedysaroides

表2 鹽溶蛋白 Nei’s遺傳一致度(右上角)和遺傳距離(左下角)Table 2 Nei’s of genetic identity (upper right corner) and genetic distance (lower left corner) of salt-soluble protein

根據(jù)3份供試材料的遺傳距離和遺傳一致度信息聚類得到聚類圖(圖2)。1(普通型)與2(濃綠型)之間距離系數(shù)為0.00，聚為一類；1、2與3(高桿型)的距離系數(shù)為0.56，3單獨聚為一類。

圖2 3個不同類型尖葉胡枝子的鹽溶蛋白聚類圖Fig.2 Dendrogram based on Nei’s genetic distance of salt-soluble proteins

2.3貯藏蛋白譜帶遺傳多樣性分析 3份供試材料之間的貯藏蛋白質(zhì)譜帶存在差異，共檢測到28條蛋白譜帶，其中19條譜帶為穩(wěn)定表達(dá)譜帶，表達(dá)率為100%；剩余9條為不同程度表達(dá)的多態(tài)性譜帶，多態(tài)率32.14%。α區(qū)有5條，β區(qū)有16條，γ區(qū)有7條，ω區(qū)無譜帶出現(xiàn)，分子量大小12.43～107.78 KDa。

表3 3個不同類型尖葉胡枝子貯藏蛋白電泳出現(xiàn)頻率和蛋白分子量Table 3 Frequency of bands and molecular weinght of storage protein of three L.hedysaroides

計算3個不同類型尖葉胡枝子貯藏蛋白的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度(表4)，普通型與濃綠型的遺傳距離最小,為0.025 1；普通型與高桿型的遺傳距離最大,為0.238 2。高桿型與普通型的遺傳一致度最小,為0.788 0；濃綠型與普通型的遺傳一致度最大,為0.975 2。

表4 貯藏蛋白 Nei’s遺傳一致度(右上角)和遺傳距離(左下角)Table 4 Nei’s of genetic identity (upper right corner) and genetic distance (lower left corner) of seed storage protein

根據(jù)3份供試材料的貯藏蛋白聚類結(jié)果可知(圖3)，1(普通型)與2(濃綠型)之間距離系數(shù)為0.02，聚為一類；1、2與3(高桿型)的距離系數(shù)為0.10，3單獨聚為一類。

圖3 3個不同類型尖葉胡枝子的貯藏蛋白聚類圖Fig.3 Dendrogram based on Nei’s genetic distance of seed storage protein

2.4不同提取液的遺傳系數(shù)方差分析 對鹽溶蛋白和貯藏蛋白提取液的遺傳距離和遺傳一致度進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示兩種提取液的遺傳系數(shù)之間沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)作為基因表達(dá)的直接穩(wěn)定產(chǎn)物，能在生化水平上反映DNA組成上的差異，種子貯藏蛋白在種子細(xì)胞內(nèi)的積累、含量高低及組分的變化受相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控[20]。因此，種子貯藏蛋白被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的研究中，包括新品種登記和保護(hù)、品種親緣關(guān)系和分類研究以及構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜等方面[21-22]。趙楊等[16]通過對二色胡枝子(L.bicolor)種子貯藏蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，14個居群貯藏蛋白電泳總譜帶數(shù)為28條，總多態(tài)帶為23條，多態(tài)帶率82.14%，胡枝子總遺傳多樣性指數(shù)為0.255，居群內(nèi)平均遺傳多樣性指數(shù)為0.136，占總遺傳多樣性指數(shù)的53.33%，說明居群內(nèi)變異是胡枝子基因結(jié)構(gòu)變異的主要來源。此外，各居群間也存在較高的遺傳分化。閆偉紅等[18]通過對40個野生居群的胡枝子屬植物種貯蛋白研究表明，供試材料的種貯蛋白譜帶的多態(tài)性達(dá)90.6%，這說明胡枝子屬植物無論在種間還是種內(nèi)都具有豐富的蛋白質(zhì)多態(tài)性。通過對胡枝子屬的蛋白質(zhì)電泳研究可以發(fā)現(xiàn)，遺傳變異大多來自胡枝子屬種內(nèi)或居群間，推斷導(dǎo)致遺傳變異的可能原因是長期生物進(jìn)化而積累的遺傳物質(zhì)的變異以及由于優(yōu)勝劣汰而逐漸適應(yīng)生境的不同生態(tài)型之間的差異。

對3個不同類型尖葉胡枝子的蛋白電泳譜帶位點進(jìn)行統(tǒng)計，不同提取液所獲得的蛋白譜帶各不相同。其中使用去離子水和0.2%NaOH溶液提取的尖葉胡枝子種子清蛋白和谷蛋白幾乎沒有或者含量甚微，使用75%乙醇溶液提取的尖葉胡枝子種子醇溶蛋白含量較少，在此不做詳細(xì)討論。利用鹽溶蛋白和貯藏蛋白提取液所得的總蛋白譜帶的分子量介于12.43～154.53 KDa，相對遷移率0.05～0.94。從電泳結(jié)果可以看出，鹽溶蛋白的γ區(qū)域是譜帶顏色、寬窄和多態(tài)性位點差異最明顯的區(qū)域；β區(qū)是貯藏蛋白均勻表達(dá)穩(wěn)定且集中的區(qū)域，γ區(qū)是譜帶多態(tài)性位點出現(xiàn)差異的區(qū)域[23-24]。鹽溶蛋白的蛋白譜帶總數(shù)為19條，多態(tài)率為68.42%,貯藏蛋白的為28條，多態(tài)率為32.14%，說明3份材料的鹽溶蛋白的條帶位點少于貯藏蛋白而種內(nèi)變異大于貯藏蛋白。聚類結(jié)果表明，利用鹽溶蛋白和貯藏蛋白獲得的蛋白質(zhì)圖譜能很好地區(qū)分鑒別3個不同類型的尖葉胡枝子，通過對鹽溶蛋白和貯藏蛋白的遺傳一致度進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示兩者之間沒有顯著差異。供試材料分為兩類:一類為普通型和濃綠型尖葉胡枝子；另一類為高桿型尖葉胡枝子，這從生化水平上證明高桿型尖葉胡枝子是尖葉胡枝子的種內(nèi)變異種。鹽溶蛋白是豆科植物種子中主要的貯藏蛋白質(zhì)[25]，且譜帶的多態(tài)性和分辨率較高，建議使用鹽溶蛋白對胡枝子屬植物的種內(nèi)(居群內(nèi))變異進(jìn)行遺傳多樣性進(jìn)行研究，效果更好。

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