趙小凱，竹俊蘭，嚴浩，王慧利

（溫州醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

·綜 述·

細菌sRNA功能、預測及鑒定方法的研究進展

趙小凱，竹俊蘭，嚴浩，王慧利

（溫州醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

細菌；sRNA；轉錄調控；生物信息學；綜述文獻

生物體中除了mRNA、tRNA、rRNA三種我們熟知的RNA外，還存在大量的非編碼RNA（non-coding RNA）。它們隱藏于基因組內的信息層，有學者稱之為基因組內“暗物質”，不可見卻執(zhí)行著新層次調控基因表達的功能[1]。研究者在對非編碼RNA的研究中發(fā)現(xiàn)了大量具有轉錄后調控功能的非編碼小RNA，如MicroRNAs（miRNAs）、Small interfering RNAs（siRNAs）、Piwi-interacting RNAs（piRNAs）、ScanRNAs（scnRNAs）等。其中，長度40至500個核苷酸的非編碼RNA通常定義為small RNA（sRNA)。sRNA廣泛存在于細菌、古生菌和真核生物體內。起初，sRNA的研究主要集中在真核生物中，近些年才漸漸把注意力集中到原核生物，尤其是病原細菌。事實上，早在1967年，就有研究者通過對大腸桿菌體內所有的RNA進行標記，在聚丙烯酰胺凝膠上探測到細菌的第一個sRNA——6SRNA[2]。

sRNA大部分位于兩編碼基因的間隔區(qū)域（IGR），小部分位于3’UTR或5’UTR。通過運用多種實驗方法和生物信息學方法發(fā)現(xiàn)，sRNA除了分布于核心基因組，有些sRNA甚至分布于插入序列、質粒、噬菌體和致病島上。日前，在大腸桿菌基因組就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約80個sRNA，且大部分在相近的致病菌中是保守的。sRNA半衰期短，通常一種sRNA有多個靶基因或靶位點，可更精確、迅速地調控多種基因的表達，具有比蛋白質調控更多的優(yōu)勢。所以，生物體內的sRNA的鑒定及其調控機制的研究成為當今生物領域新的研究熱點?，F(xiàn)就細菌sRNA的功能，與其伴侶分子Hfq的關系，預測和實驗驗證方法的進展作一綜述。

1 細菌sRNA的功能

細菌sRNA能與靶基因互補配對，并主要通過與mRNA翻譯區(qū)結合影響mRNA的穩(wěn)定性或者與mRNA的3’UTR結合調控mRNA的翻譯來調控靶基因的表達和蛋白質的穩(wěn)定性。研究表明，sRNA能通過上述轉錄后調控方式參與多種生物學過程，如對環(huán)境的應答、物質代謝、蛋白質的合成、致病性等。

1.1 調控RpoS蛋白（RNA聚合酶的σ亞基）的sRNA細菌轉錄因子σ（RNA聚合酶的σ亞基）的編碼基因rpoS，當遇到生存壓力如溫度、饑餓、滲透壓及pH的變化時，可轉錄大量應答基因，作出應激反應，適應環(huán)境變化。研究發(fā)現(xiàn)一些sRNA能與靶mRNA rpoS堿基配對，在翻譯水平上調節(jié)其表達，從而在對環(huán)境的應答反應中發(fā)揮著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)有4種sRNA：OxyS、DsrA、RprA、ArcZ參與rpoS的轉錄后調控過程。DsrA、RprA和ArcZ能夠激活RpoS蛋白的翻譯，而OxyS則抑制其表達。

在環(huán)境壓力下，如在低溫時，DsrA通過干擾5’UTR的抑制子二級結構來激活RpoS蛋白的翻譯，以適應環(huán)境，DEAD-box作為輔助因子[3]。DsrA還能保護rpoS，防止其被RNase E降解[4]。在病原菌沙雷菌屬中，RprA通過正向調節(jié)rpoS翻譯的方式來調節(jié)抗生素——碳青霉烯的產生[5]。研究還發(fā)現(xiàn)在缺乏DsrA、RprA時，rpoS很不穩(wěn)定，DsrA、RprA的高表達能增加RpoS蛋白的積累和半衰期。ArcZ是利用特異的sRNA文庫檢測rpoS翻譯調節(jié)時發(fā)現(xiàn)的第四種sRNA[6]。和DsrA和RprA一樣，ArcZ能與rpoS堿基配對，解開其5’UTR的莖環(huán)結構，激活RpoS蛋白的翻譯，從而對惡劣的環(huán)境作出應答反應。相反，OxyS則作為負調控子，有文獻[7]報道其能抑制RpoS蛋白的合成，應答環(huán)境低氧信號。

1.2 調控需鐵蛋白的sRNA鐵是細菌代謝的最重要金屬之一，在胞內的許多酶促反應里起著輔助因子的作用。鐵饑餓是影響細菌感染能力的主要因素之一。許多細菌細胞內，轉錄抑制子鐵吸收調節(jié)子（ferric uptake regulator，簡稱Fur)，能正向調節(jié)一些參與儲存鐵的基因，控制胞內鐵穩(wěn)態(tài)。現(xiàn)今已有很多文獻報道稱，sRNA能調節(jié)Fur，在減緩細菌的鐵饑餓中起著重要作用。如最近在淋球菌中發(fā)現(xiàn)的sRNA——nrrF，對其轉錄本分析發(fā)現(xiàn)，它能轉錄后抑制編碼含鐵-硫中心的黃素蛋白-琥珀酸脫氫酶的sdhA和sdhC基因的表達[8]。與大腸桿菌的RyhB通過與RNase E形成降解復合體對sodB、sdhC等mRNA降解機制相似，通過減少需鐵蛋白，使細胞內的鐵離子重新分配，從而保持細菌細胞內部的鐵穩(wěn)態(tài)。

接著，研究者又在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了相似功能的sRNA——FsrA，F(xiàn)srA能與三種蛋白FbpA、FbpB和FbpC共同作用，抑制包括三羧酸循環(huán)在內的烏頭酸酶和琥珀酸脫氫酶以及含鐵硫簇的谷氨酸合酶等含鐵蛋白的合成[9]。此外，近期通過生物信息學手段，從假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了RyhB的同源基因PrrF[10]，同樣具有調控鐵代謝的功能。

1.3 調控OMPs等外膜蛋白的sRNA革蘭氏陰性細菌細胞壁的外膜攜帶有多種高免疫原性的外膜蛋白（OMPs）。研究發(fā)現(xiàn)，sRNA還可抑制革蘭氏陰性菌細胞表面蛋白OMPs的合成。在腸道菌中已發(fā)現(xiàn)InvR、MicA、MicC、MicF、RybB等十余種sRNA可調節(jié)mRNA omp的表達。

我們已經(jīng)知道在大腸桿菌和沙門氏菌中存在著受外膜壓力因子σE誘導的sRNA——RybB。 RybB可與靶標mRNA omp的5’UTR或編碼區(qū)發(fā)生不完全堿基配對，抑制多種OMPs的合成[11]。此外，沙門菌中依賴Hfq的sRNA MicC可調節(jié)主要外膜蛋白OmpD的合成[12]。最近在沙門菌中又發(fā)現(xiàn)一種新sRNA SdsR，先前在大腸桿菌中稱作RyeB，是最豐富的靜止期特異性sRNA。研究發(fā)現(xiàn)SdsR是繼InvR、MicC和RybB 后第四個能下調沙門菌的外膜孔蛋白OmpD合成的sRNA。通過3’RACE發(fā)現(xiàn)SdsR很有可能識別OmpD起始密碼子的下游，從而配對發(fā)揮轉錄后調節(jié)作用[13]。同樣在腸道菌，有研究者通過點突變發(fā)現(xiàn)，sRNA MicM能通過反義機制，隔絕ybfM的核糖體結合位點，從而沉默細胞表面蛋白YbfM[14]。此外，在其他腸道細菌也存在可以調控外膜蛋白合成的sRNA，如霍亂弧菌中的VrrA、志賀氏菌中的RnaG等。

1.4 調控生物膜形成的sRNA轉錄因子CsgD 通過掌控curli菌毛和纖維素的產生而決定大腸桿菌是否能形成生物膜。最近報道發(fā)現(xiàn)CsgD的mRNA是sRNA介導的信號整合的中樞[15]。

研究發(fā)現(xiàn)McaS、RprA和GcvB三種sRNA能調節(jié)csgD基因翻譯。McaS是一個95 nt的sRNA，它通過三個不相連的單鏈區(qū)域來調節(jié)與生物膜形成相關的靶mRNA。例如，McaS能激活最主要的鞭毛合成轉錄因子flhD蛋白。同時，McaS還能調節(jié)一種與多聚糖β-1，6-N-乙?；?D-葡糖胺的出膜相關的膜孔蛋白pgaA。研究還發(fā)現(xiàn)高濃度的McaS能促進生物膜的形成，而缺乏McaS的菌株出現(xiàn)不完整的生物膜[16]。通過廣泛的突變分析發(fā)現(xiàn)，RprA能直接結合csgD的5’ UTR和翻譯起始位點，和McaS一樣抑制csgD的翻譯[17]，GcvD也一樣。

此外，在其他細菌中也發(fā)現(xiàn)sRNA如銅綠假單胞菌中的SagS[18]，腸炎沙門菌的MicA[19]等多種sRNA通過調控相關蛋白而影響生物膜的形成。

1.5 調控毒力蛋白的sRNA毒力的產生由一系列毒力基因介導，這些基因除少數(shù)存在于質粒外，大多數(shù)存在于染色體上。以往的研究表明，sRNA能通過調節(jié)毒力相關的靶標基因的表達，從而調控病原菌對宿主的侵襲力、在巨噬細胞中的存活力、對宿主細胞的黏附力以及毒力蛋白的分泌。

沙門菌編碼SPI-1效應器的SopA蛋白和SPI-1蛋白的主要調節(jié)蛋白HilE，兩者都是沙門菌的侵染所需的主要毒力因子。研究發(fā)現(xiàn)沙門菌致病島基因編碼的sRNA——IsrM， 能與這兩個蛋白的mRNA相互作用，從而在沙門氏菌侵入上皮細胞、在巨噬細胞內復制及在小鼠體內的毒力與復制中發(fā)揮著關鍵作用[20]。

內膜蛋白MgtC，存在于多種致病菌中，是病原菌對小鼠的毒力及其在巨噬細胞中存活所必需的。研究發(fā)現(xiàn)沙門菌中順式編碼的反義sRNA AmgR可與mgtC部分序列堿基互補從而抑制其表達[21]。此外，在蘇云金芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)一些對芽孢形成、殺蟲晶體蛋白表達起分子調控的sRNA。還有很多文獻報道sRNA能調控毒力蛋白mRNA的翻譯。如金黃色葡萄球菌中RNAIII，鼠傷寒沙門氏菌IsrJ，嗜肺軍團桿菌RsmY和RsmZd等。

1.6 調控其他功能的sRNA大腸桿菌的碳儲存調節(jié)者（carbon storage regulation，簡稱Csr），是主要包含CsrB、CsrC兩種sRNA、RNA結合蛋白CsrA和蛋白CsrD的調節(jié)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，CsrA能通過結合多種靶mRNA抑制糖異生和糖原代謝等過程，而CsrB、CsrC能阻止CsrA與其靶mRNA的相互結合[22]。借助生物信息學對假單胞菌基因間區(qū)域O1分析發(fā)現(xiàn)了一個sRNA——NalA，且PAO1區(qū)硝酸鹽同化作用操縱子的表達需要這個sRNA[23]。在過氧化物壓力下，大腸桿菌的sRNA RybA能調節(jié)芳香族氨基酸的生物合成的主要基因TyrR，參與芳香族化合物包括芳香族氨基酸的代謝的上調[24]。變異鏈球菌存在一種sRNA L10-Leader，通過生物信息學預測它的靶mRNA，發(fā)現(xiàn)有5種mRNA，這5種mRNA都參與鏈球菌的生長和應激反應。定量反轉錄發(fā)現(xiàn)，在不同生長環(huán)境中mRNA的表達水平與L10-Leader的濃度水平密切相關[25]。

此外，sRNA還有如DicF參與染色體復制和細胞分化[26]、RNAI質?？截悢?shù)控制[27]以及ncrMT1302參與cAMP代謝[28]等多種功能。這里不再一一介紹。

2 sRNA與其伴侶分子Hfq

Hfq（host factor for Qβ replicase）是細菌轉錄后調節(jié)子，是一類豐富的高度保守的Lsm/Sm家族剪接蛋白，具有RNA分子伴侶活性。Hfq最初是作為大腸桿菌RNA噬菌體QB復制所需要的宿主因子被發(fā)現(xiàn)的。細胞電鏡影像顯示Hfq蛋白定位細菌的細胞膜附近。至今為止發(fā)現(xiàn)Hfq參與許多由sRNA介導的功能調控，在體內能結合并穩(wěn)定sRNA，能促進sRNA與靶mRNA的堿基配對，從而調節(jié)mRNA的轉錄。上面介紹的sRNA功能幾乎都有Hfq的參與。而且Hfq的缺失將引起相關表型的改變。如生長速度減慢，細胞增大，對紫外光敏感度增加等。

最近的研究集中在Hfq結合RNA的機制方面。我們已經(jīng)知道Hfq是通過形成六聚體環(huán)形式結合RNA的，且Hfq既能結合sRNA，又能結合mRNA。sRNA的PolyU尾巴對于Hfq的功能發(fā)揮是必需的[29]，此外最近研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過突變和生化分析，大腸桿菌SgrS的內部發(fā)夾結構和上游的U富集序列對于Hfq的有效結合也是必需的[30]。Hfq的結合還與細菌基因組的CG含量和經(jīng)實驗驗證sRNA與mRNA配對的自由能也存在顯著的關系。

在正常的條件下，Hfq會限制sRNA的功能，大量sRNA競爭Hfq的結合位點，一些相對較少的sRNA會缺失與Hfq的結合，導致其轉錄后調節(jié)基因表達功能活性的降低[31]。同時，sRNA也能影響Hfq。通過體外重組實驗，在野生型細胞中體外提取得到Hfq多聚體與RyhB的融合體，但在RelA突變的細胞內沒有。結果顯示RelA能促進Hfq單體形成多聚體，進而促進其結合RyhB及其他sRNA[32]。

并不是所有細菌都含有Hfq蛋白，研究發(fā)現(xiàn)在螺旋菌中缺少RNA伴侶蛋白Hfq的同源蛋白。通過與sRNA的親和層析和免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S1和一種未知功能的蛋白HP1334與sRNA有相互作用[33]。

3 sRNA的預測方法

目前，基因組學研究正從結構基因組（structural genomics）向功能基因組（functional genomics）邁進，高通量深度測序（Deep parallel sequencing）技術（如454、Solexa和Solid等）也日臻完善，這為挖掘更多的sRNA提供了可能。如通過454焦磷酸測序發(fā)現(xiàn)紅桿菌存在大量的sRNA[34]； 對灰色鏈球菌的Solid全基因組測序，也發(fā)現(xiàn)了大量的干擾RNA[35]。而Solexa主要用于病毒sRNA的預測。 sRNA的預測方法也隨著生物信息學的發(fā)展，從原先的克隆測序、標記染色進化到如今的生物信息學預測、生物芯片（Microarray）等方法。利用生物信息學方法，包括同源搜索、比較基因組預測、利用序列和結構特征分析（如RNA的二級結構）預測不同物種基因組或EST序列庫中存在的sRNA成為現(xiàn)今廣泛應用的方法。而生物信息學的方法不考慮sRNA的表達情況，基于IGR的保守性、RNA結構保守性和機器學習算法（machine-learning approach）預測sRNA，然后用Northern blots、RT-PCR、RNomics和RACE驗證。但是生物信息學方法卻會漏掉物種特有（不保守的）、較長轉錄以及位于ORF反鏈的sRNA。因此，理想的方法是運用生物信息學方法和高通量的測序方法相結合來發(fā)現(xiàn)新的sRNA，并根據(jù)新sRNA的特征，發(fā)展新算法，提高sRNA的預測效率。

計算機預測一直獲得人們的親睞，2011年劉倩等[36]報道了一種基于轉錄終點序列特征預測大腸桿菌sRNA的方法。該方法介紹了一個基于已知細菌sRNA轉錄終點的堿基頻率矩陣來識別sRNA的預測策略，并在大腸桿菌K.12 MG1655中進行了sRNA的預測確證，并表明該模型在獨立測試中具有較高的特異性和陽性檢出率。國外Sridhar等[37]利用計算機軟件sRNA scanner對已全基因組測序的S.Typhimurium LT2的基因間sRNA檢測，發(fā)現(xiàn)118個潛在的sRNA，最后通過Northern印跡和5’RACE分析，確定了6種sRNA。

此外，sRNA常常以一種與Hfq結合為復合物的方式存在?？赡苓@些sRNA只有與Hfq結合才具有活性，或是只有結合在一起才能修飾和調節(jié)目標蛋白。因此，可以利用Hfq的抗體免疫共沉淀方法或sRNA與Hfq結合原理的基因組SELEX方法，來尋找細菌中新的結合Hfq的sRNA。

4 細菌sRNA的實驗驗證

目前對預測得到的sRNA進行實驗驗證主要有兩種方法，Northern印跡和熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR）。Northern印跡/PAGE是獲得小RNA表達證據(jù)的通用關鍵技術，也是在無擴增時定量測量sRNA的標準方法。目前大多數(shù)研究者將Northern印跡作為鑒定sRNA的金標準。最近報道根癌土壤桿菌中就是通過Northern印記從228個sRNA中驗證到了22個sRNA分子[38]。然而，Northern印跡的最大缺點是對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性。而sRNA樣品往往難以獲得，其原因主要是sRNA在細菌中含量少、容易降解、制備sRNA樣品價格也非常昂貴。

FQ-PCR也可用于鑒定sRNA分子。與Northern印跡方法相比，F(xiàn)Q-PCR方法雖然可以高度靈敏地檢測出低豐度表達的sRNA分子，但同樣容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。目前有多種FQ-PCR方法來鑒定sRNA，包括莖環(huán)引物熒光定量逆轉錄PCR；快速擴增cDNA 3’-末端的熒光定量逆轉錄PCR等。

此外，通過RNomics方法（即鳥槍克隆法），建立小轉錄本（40～500 nt）cDNA文庫，通過雜交去除rRNA和tRNA，然后測序；用高密度寡核苷酸探針對sRNA進行探測，并且已成功運用于E.coli、P.Aeruginosa等基因組sRNA的確認鑒定。

5’-RACE和3’-RACE常和Northern印跡一起用于sRNA的驗證。如Chen等[39]驗證大腸桿菌內存在一種新的sRNA——Esre。

隨著新一代測序技術的發(fā)展，不僅可為我們提供全局的sRNA表達譜，而且能夠發(fā)現(xiàn)sRNA的長度變化以及酶修飾（如RNA編輯）。但是在生物體內低豐度表達、特定條件表達的sRNA仍然很難通過實驗的方法檢測到。

5 研究展望

隨著基因組學和生物信息學的迅速發(fā)展以及對RNA分子特性研究的深入，將會發(fā)現(xiàn)越來越多的細菌sRNA分子。迄今發(fā)現(xiàn)的細菌sRNA數(shù)目雖然已經(jīng)很多，但目前只有很少部分sRNA功能已通過實驗確定，新非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)還有很大的發(fā)掘空間，并且已發(fā)現(xiàn)的大部分非編碼RNA的生理功能尚不清楚。因此，對非編碼RNA的功能研究方法需要越來越完善。而且sRNA生物功能的多樣性，在病原菌的毒力、代謝等環(huán)節(jié)都起著至關重要的作用，也許將來能成為疾病控制的新靶點。另外，在最古老的原核生物藍細菌中sRNA的調控機制研究的還比較少，至于sRNA的遺傳進化機制與生物的演化關系如何，sRNA的功能與環(huán)境脅迫是否存在因果關系，也有待于進一步探討。

再者，盡管sRNA篩選和鑒定的方法（如遺傳學方法、免疫共沉淀法、基因芯片、基因和質粒翻譯融合及生物信息學等）已比較成熟，但是這些方法也有各自的特點和局限性。所以我們應根據(jù)所研究的sRNA的特點采取合適的方法，或聯(lián)合應用多種方法來避免各種方法的弊端，同時我們期待建立更好的篩選和鑒定sRNA的方法。

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（本文編輯：吳健敏）

Q3

C

1000-2138（2012）05-0503-05

2012-06-15

國家自然科學基金資助項目（31071115，31270548）；浙江省科技廳公益項目（2011C23114）。

趙小凱（1990-），男，浙江嘉興人，碩士生。

王慧利，博士，副教授，Email：whuili@163.com。