孫軍德，王鶴，侯靜，郝捷

(沈陽農(nóng)業(yè)大學，遼寧沈陽110866)

隨著人口增長和人們生活水平的提高，能源危機、食物短缺和環(huán)境污染等問題日益嚴重，尋找開發(fā)新能源、減少環(huán)境污染的有效途徑，顯得越來越重要。纖維素是地球上最大的可再生有機資源［1-3］，可廣泛用于生產(chǎn)酒精、沼氣、牲畜飼料、肥料等領域［4］。我國各類農(nóng)作物纖維資源十分豐富，其中玉米秸稈約2.2億t［5］，除了少部分被利用外，大部分堆積、燒荒等造成污染和浪費。本文采用自行篩選獲得的1株產(chǎn)纖維素酶活力較高的瓦克青霉菌株，開展降解玉米秸稈模擬試驗，為進一步的研究利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離自沈陽農(nóng)業(yè)大學植物園覆蓋枯枝敗葉的土樣和腐木，經(jīng)鑒定為瓦克青霉(Penicillium waskmanii ZN6)，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學微生物學實驗室。

1.1.2 秸稈降解培養(yǎng)基玉米秸稈粉4 g，麩皮1 g，KH2PO44 g/L，(NH4)2SO416 g/L，MgSO41 g/L，CaCl2·2H2O 3 g/L。

1.2 方法

1.2.1 酶活測定方法粗酶液的制備:將發(fā)酵液于4℃、8 500 r/min下離心10 min，得到上清液即為粗酶液。FPA酶活力測定:參照馮磊［6］的方法稍作改進，取1 mL稀釋適當倍數(shù)的酶液，加入以1 cm×6 cm的卷成小卷的新華濾紙為底物1 mg，再加入1 mL pH 4.8的醋酸緩沖溶液于55℃保溫60 min，再加入3 mL DNS試劑，于沸水中煮15 min，在550 nm處比色。以1 mL酶液1 min由底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位，用IU/g表示。

1.2.2 試驗方法采用單因素試驗，F(xiàn)PA酶活力為測定指標，考察菌株降解秸稈的主要條件，每個處理設3次重復，數(shù)據(jù)用Excel軟件處理取其平均值。①降解時間:以PDA液體培養(yǎng)基120 r/min搖床培養(yǎng)48 h的ZN6菌液做種子，按10%接種量(體積比)接種于秸稈降解培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)，每隔24 h測FPA酶活力;②接種量:以PDA液體培養(yǎng)基120 r/min搖床培養(yǎng)48 h的ZN6菌液為種子，接種量(體積比)分別為2%、6%、10%、14%接種于秸稈降解培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)72 h后測FPA酶活力;③降解溫度:以PDA液體培養(yǎng)基120 r/min搖床培養(yǎng)48 h的ZN6的菌液按10%接種量(體積比)接入秸稈降解培養(yǎng)基中，分別于26、29、32、35、38℃下培養(yǎng)72 h測FPA酶活力;④初始pH:以PDA液體培養(yǎng)基120 r/min搖床培養(yǎng)48 h的ZN6的菌液按10%接種量(體積比)接入起始pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的秸稈降解培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)72 h后測FPA酶活力;⑤麩皮含量:以PDA液體培養(yǎng)基120 r/min搖床培養(yǎng)48 h的ZN6的菌液按10%接種量(體積比)接入起始pH為5.0的麩皮含量分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%的秸稈降解培養(yǎng)基32℃培養(yǎng)72 h后測FPA酶活力。

2 結果與分析

2.1 降解時間與FPA酶活力的關系

圖1 降解時間對FPA酶活力的影響Fig.1 Effect of degradation condition on FPA activity

由圖1可知，酶的活力隨著降解時間的推移不斷增大;在48～72 h內(nèi)增幅比較大，當培養(yǎng)到第72 h時，F(xiàn)PA酶活力達到最大值4.53 IU/g，72 h后酶活力增加緩慢，變化不明顯。因此，降解時間以72 h為最好。

2.2 接種量對FPA酶活力的影響

圖2 接種量對FPA酶活力的影響Fig.2 Effect of inoculation quantity on FPA activity

如圖2表明，接種量為6%時酶活力最高，培養(yǎng)基營養(yǎng)比較充足。接種量過低使得營養(yǎng)過剩，菌絲體徒長，產(chǎn)酶相對滯后;接種量過大使得菌絲體增長迅速，培養(yǎng)后期營養(yǎng)匱乏，不利于產(chǎn)酶，因此最適接種量為6%。由此可見，接種量對酶活力有很大影響。

2.3 降解溫度對FPA酶活力的影響

圖3 降解溫度對FPA酶活力的影響Fig.3 Effect of degradation temperature on FPA activity

如圖3所示產(chǎn)酶的最適溫度是32℃，溫度過低，菌體生長緩慢，孢子數(shù)量少，但是酶活力高峰期出現(xiàn)晚。溫度過高，菌體生長旺盛，孢子多，但酶量偏低。

2.4 起始pH值對FPA酶活力的影響

圖4 初始pH對FPA酶活力的影響Fig.4 Effect of original pH on FPA activity

如圖4所示，在pH 4.5～6.5范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，酶活呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，產(chǎn)酶最適起始pH值在5.0。

2.5 麩皮含量對FPA酶活力的影響

圖5 麩皮含量對FPA酶活力的影響Fig.5 Effect of the ratio of wheat bran on FPA activity

從圖5可以看出，當麩皮含量為20%時酶活力達到最高。而隨著麩皮含量的增加酶活力反而呈現(xiàn)降低的趨勢。麩皮含量從0%～10%酶活力增加明顯，10%～20%增加緩慢。由此可見，麩皮對菌種酶活力的影響是雙向的。一方面在降解初期為產(chǎn)酶提供必要的營養(yǎng)因子，提高降解初期的動力;另一方面，麩皮量增加又會降低培養(yǎng)基的蓬松程度，使通氣量降低，從而影響酶活力。根據(jù)生產(chǎn)實際需要，從節(jié)約成本角度出發(fā)，麩皮含量定在10%為宜。

3 討論

具有高產(chǎn)纖維素酶的菌株有利于更好地將秸稈纖維素轉(zhuǎn)換為乙醇及其他產(chǎn)品。本實驗所用瓦克青霉(Penicillium waskmanii ZN6)具有降解玉米秸稈的潛力，通過降解條件研究結果顯示，在適宜的條件下:降解時間72 h，降解溫度32℃，起始pH 5.0，麩皮10%，發(fā)酵液濾紙酶活可達6.27 IU/g。

本實驗通過對瓦克青霉降解玉米秸稈條件的初步研究，優(yōu)化了其降解玉米秸稈的條件，為進一步研究秸稈轉(zhuǎn)化為燃料物質(zhì)提供了基礎。

［1］ 胡春霞，宋會儀.真菌纖維酶及其在飼料中的應用［J］.飼料工業(yè)，2006，27(16):15-17.

［2］ M.Petre，G，Zarnea，P.Adrian，et al.Biodegradation and bioconversion of cellulose wastes using bacterial and fungal cells immobilized in radiopolymerized hydrogels［J］.Resource Conservation and Recycling，1999，27(5):309-332.

［3］ Scott TA，Hall JW.Using acid insoluble ash marker ratios to predict digestibility of wheat and barley metabolizable energy and nitrogen retention in broiler chicks［J］.Poult Sci，1998，77(5):674-679.

［4］ 汪海波，秦元萍，余康，等.我國農(nóng)作物秸稈資源的分布、利用與開發(fā)策略［J］.國土與自然資源研究，2008，(2):92-93.

［5］ 張繼泉，孫玉英，關鳳梅，等.玉米秸稈纖維素酶解條件的初步研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2002，(4):21-23.

［6］ 馮磊.工業(yè)纖維素酶的測定和比較［J］.無錫輕工業(yè)學院學報，1994，3(4):323-329.