莫樹(shù)平王惠惠柏建玲

張菊梅1，2，3，4吳清平1，2，3，4丘明泉1，2，3，4

（1.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070；2.廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；3.廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；4.廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室－省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣東 廣州 510070）

ε－聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，由25～30個(gè)賴氨酸殘基聚合而成。ε－聚賴氨酸具有優(yōu)良的抑菌效果，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌作用，并且對(duì)一些耐熱性芽孢桿菌和病毒也有一定抑制作用。同時(shí)，ε－聚賴氨酸還具有熱穩(wěn)定性好、水溶性強(qiáng)、安全性高、不影響食品風(fēng)味等特點(diǎn)［1－3］。

乳酸鏈球菌、納他霉素是中國(guó)衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)使用的食品防腐劑，安全健康、抑菌效果好，但兩者抑菌譜相對(duì)較窄，ε－聚賴氨酸抑菌譜廣、水溶性強(qiáng)、安全性高，三者復(fù)配使用，抑菌效果增強(qiáng)，抑菌譜互補(bǔ)，擴(kuò)展了抑菌譜，有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景［4］。目前，ε－聚賴氨酸在日本、韓國(guó)、美國(guó)等已經(jīng)批準(zhǔn)作為新型生物食品添加劑使用，廣泛應(yīng)用于肉類(lèi)［5，6］、家禽、海產(chǎn)品、面包、米飯、蛋糕、餅干［7］、飲料［8］、醬油等食 品中。而中國(guó)相關(guān)法律法規(guī)尚不完善，ε－聚賴氨酸尚未列入食品添加劑目錄［9，10］。

本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究工作表明［11－13］，以ε－聚賴氨酸為主要防腐劑，與乳酸鏈球菌素和納他霉素進(jìn)行復(fù)配優(yōu)選得到的生物防腐劑，對(duì)廣式臘腸、禽畜魚(yú)類(lèi)、生鮮肉等食品中的常見(jiàn)污染菌均有良好的防腐效果。

本試驗(yàn)選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等致病菌和酵母、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉等食品中常見(jiàn)污染菌，采用紙碟法，有針對(duì)性的進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，評(píng)估復(fù)合生物防腐劑對(duì)這些常見(jiàn)致病菌的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

乳酸鏈球菌素（Nisin）：食品級(jí)，廣東大地食用化工有限公司；

納他霉素：食品級(jí)，廣東大地食用化工有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

大腸 桿 菌（Escherichia coli，8099）、金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、白色念珠菌（Candida albicans，ATCC10231）、枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis，ATCC9372）、黑曲菌（Aspergillus niger，ATCC16404）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC15442）、清酒酵 母 （Saccharomy ces sake，ACCC20045）、嗜 酸 乳 桿 菌（Lactobacillus acidophilus，ATCC4356）：廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備 將指示菌菌種接種于試管斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接兩次將菌種活化，菌種活化后，接入液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24h，制備菌懸液；稱取乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸，用去離子水配制成2%濃度的配方溶液；用打孔器制作直徑0.6cm 的圓形濾紙片。

1.2.2 乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸的抑菌試驗(yàn)

采用紙碟法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲菌、銅綠假單胞菌、酵母菌和乳酸菌為指示菌，取0.1mL指示菌菌懸液于培養(yǎng)基平板，用滅菌刮鏟涂布均勻，放置浸泡過(guò)濃度2%的乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε－聚賴氨酸溶液的圓形濾紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈的有無(wú)，初步評(píng)估抑菌效果。

1.2.3 復(fù)合生物防腐劑的抑菌試驗(yàn) 以ε－聚賴氨酸為主要原料，按一定比例添加Nisin、納他霉素等復(fù)配制成復(fù)合生物防腐劑，前期通過(guò)預(yù)試驗(yàn)獲取了抑菌效果較佳的9 個(gè)配方（見(jiàn)表1），采用紙碟法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲菌、銅綠假單胞菌、酵母菌及乳酸菌為指示菌，取0.1mL指示菌菌懸液于培養(yǎng)基平板，用滅菌刮鏟涂布均勻，放置浸泡過(guò)2%復(fù)合生物防腐劑的圓形濾紙片，以空白圓形濾紙片作對(duì)照，37 ℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈的有無(wú)，初步評(píng)估抑菌效果。

表1 復(fù)合生物防腐劑各復(fù)配組配方Table 1 Complex biological preservatives formula／（g·kg－1）

1.2.4 ε－聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、納他霉素及復(fù)合生物防腐劑的抑菌試驗(yàn) 采用紙碟法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲菌、銅綠假單胞菌、酵母菌和乳酸菌為指示菌，取0.1mL 指示菌菌懸液于培養(yǎng)基平板，用滅菌刮鏟涂布均勻，放置分別經(jīng)2%的乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε－聚賴氨酸及復(fù)合生物防腐劑溶液浸泡過(guò)的圓形濾紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈的直徑，評(píng)估比較各防腐劑的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸的抑菌效果

由表2可知，乳酸鏈球菌素能有效地抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，但對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌、銅綠假單胞和酵母菌等沒(méi)有抑菌效果；納他霉素能有效地抑制革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌、真菌白色念珠菌、黑曲霉和酵母菌的生長(zhǎng)，但對(duì)陽(yáng)性細(xì)菌沒(méi)有抑制效果；ε－聚賴氨酸對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌與革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌及真菌白色念珠菌、黑曲霉和乳酸菌均有抑菌效果。

2.2 復(fù)合生物防腐劑的抑菌效果

由表3可知，復(fù)合生物防腐劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌與革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌及真菌白色念珠菌、黑曲霉和乳酸菌均有抑菌效果。與乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε－聚賴氨酸相比，復(fù)合生物防腐劑的抑菌效果得到互補(bǔ)，抑菌譜拓寬。

2.3 ε－聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、納他霉素及復(fù)合生物防腐劑的抑菌效果

ε－聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、納他霉素及復(fù)合生物防腐劑的抑菌效果見(jiàn)表4。

表2 乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸的抑菌效果Table 2 Nisin，Natamycin andε－polylysine bacteriostasis effect

表3 復(fù)合生物防腐劑的抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effects of complex biological preservatives

表4 各防腐劑的抑菌圈直徑Table 4 The antiseptic antibacterial circle diameter ／cm

由表4可知，相比各單體防腐劑，乳酸鏈球菌素、納他霉素與ε－聚賴氨酸的復(fù)配擴(kuò)展了抑菌譜，復(fù)合生物防腐劑對(duì)指示菌中的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌均表現(xiàn)出了抑菌作用；單體防腐劑的復(fù)配同時(shí)也加強(qiáng)了抑菌效果，復(fù)合生物防腐劑4、5、7對(duì)乳酸菌的抑菌圈直徑達(dá)到了1.8cm以上，復(fù)合生物防腐劑9 對(duì)白色念珠菌的抑菌圈直徑為1.7cm，明顯強(qiáng)于其它防腐劑的抑菌效果。

3 討論

乳酸鏈球菌素是一種高效、無(wú)毒、安全、無(wú)副作用的天然食品防腐劑，能有效抑制革蘭氏陰性菌，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、霉菌等無(wú)效；納他霉素是一種天然、廣譜、高效安全的真菌抑制劑，常用于食品的表面防腐；聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，具有抑菌譜廣、水溶性好、安全性、抑菌范圍廣等特點(diǎn)。3種防腐劑復(fù)配后的復(fù)合生物防腐劑擴(kuò)展了抑菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都表現(xiàn)出了顯著的抑菌作用。

單體防腐劑的復(fù)配不但擴(kuò)展了抑菌譜，而且增強(qiáng)了對(duì)指示菌的抑菌作用。復(fù)合生物防腐劑3、4、7對(duì)乳酸菌的抑菌效果明顯強(qiáng)于其它單體防腐劑及復(fù)配組合，復(fù)合生物防腐劑7對(duì)乳酸菌的抑菌圈直徑為2.2cm，明顯大于乳酸鏈球菌素和ε－聚賴氨酸對(duì)乳酸菌的抑菌圈直徑1.6，1.2cm。

ε－聚賴氨酸安全、易分解，不僅在食品業(yè)有廣泛的應(yīng)用，在醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用也有不斷拓展。目前，ε－聚賴氨酸在日本已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，中國(guó)尚處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段。篩選產(chǎn)ε－聚賴氨酸的高產(chǎn)菌株，提高ε－聚賴氨酸的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)將是今后的重點(diǎn)研究工作。

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