寇彥杰，華君，秦嶺

（成都華高藥業(yè)有限公司，四川成都610041）

天然甜味劑甜菊糖甙的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

寇彥杰，華君，秦嶺

（成都華高藥業(yè)有限公司，四川成都610041）

對(duì)比研究當(dāng)前國內(nèi)和國際上天然甜味劑甜菊糖甙的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并將各標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，探討適用于以甜葉菊干葉為原料，經(jīng)提取、精制而得各種規(guī)格甜菊糖甙產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

甜菊糖甙；天然甜味劑；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertohi），為菊科（Composital）斯臺(tái)比亞屬（Stevia），多年生草本植物。甜菊糖甙（steviol glycosides）是從甜葉菊的葉和莖中提取出來的高甜度、低熱量天然甜味劑，它主要含9種[2-4]不同甜味成分：甜菊甙（Stevioside），瑞鮑迪甙（Rebaudioside A、B、C、D、F），杜克甙（Dulcoside A），甜茶甙（Rubusoside）和甜菊雙糖甙（Steviolbioside）。目前與天然甜味劑甜菊糖甙產(chǎn)品相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有：國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)的中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 8270-1999食品添加劑甜菊糖甙[1]，以下簡稱GB8270-1999；糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives）發(fā)布的Steviol Glycosides[2]，以下簡稱JECFA 2010；美國《食品化學(xué)法典》（Food Chemicals Codex）發(fā)布的Rebaudioside A[3]，以下簡稱FCC 2009。隨著甜菊糖甙提取、分離純化生產(chǎn)工藝技術(shù)水平的提高，實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)上述單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)不能滿足目前甜菊糖甙產(chǎn)品的質(zhì)量控制要求。因此，對(duì)比研究上述3個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，探討適用于以甜葉菊干葉為原料，經(jīng)提取、精制而得的各種規(guī)格甜菊糖甙產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為甜菊糖甙產(chǎn)品的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供參考。

表1 GB 8270-1999食品添加劑甜菊糖甙理化指標(biāo)

表2 JECFA 2010 Steviol Glycosides理化指標(biāo)

表3 FCC 2009 Rebaudioside A理化指標(biāo)

1 甜菊糖甙質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡介

1.1 我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 8270-1999食品添加劑甜菊糖甙

外觀：白色、微黃色松散粉末或晶體。理化指標(biāo)見表1。

1.2 JECFA 2010 Steviol G lycosides標(biāo)準(zhǔn)

外觀：白色、淺黃色粉末，有輕微特有的氣味或無味。理化指標(biāo)見表2。

1.3 FCC 2009 Rebaudioside A標(biāo)準(zhǔn)

外觀：白色、類白色精細(xì)晶體，顆?；蚍勰?，具有吸濕性，甜味。理化指標(biāo)見表3。

1.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要差異對(duì)比

對(duì)比上述3個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)存在的主要差異見表4。

2 甜菊糖甙質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定的研究

2.1 儀器和試藥試劑

Agilent1200高效液相色譜儀（配備在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器）；CP225D型電子分析天平（Sartorius公司）；DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；PHS-25C型pH酸度計(jì)；KQ-250B型超聲波清洗器。對(duì)照品Stevioside（99.2%）和Rebaudioside A（98.3%）購自日本和光株式會(huì)社（Wako Pure Chemical Industries，Ltd）以下簡稱Wako；Stevioside（98.6%）和Rebaudioside A（96.2%）購自美國ChromaDex公司，以下簡稱ChromaDex；Stevioside（98.4%）和Rebaudioside A（98.3%）購自美國藥典（U.S.Pharmacopeia）以下簡稱USP；甜菊糖甙樣品（含量95%、90%、85%、80%、Rebaudioside A≥97%和Stevioside≥90%等規(guī)格）由成都華高藥業(yè)有限公司提供。乙腈為色譜純，購自美國Fisher公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；水為重蒸鎦水。

2.2 高效液相色譜條件

2.2.1 GB 8270-1999標(biāo)準(zhǔn)色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX NH24.6mm×250 mm 5μm；流動(dòng)相：乙腈-水（80∶20）；流速：1.2mL/min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：15μL。按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法對(duì)各規(guī)格甜菊糖甙進(jìn)行檢測并記錄色譜圖，見圖1。

表4 3種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)差異的對(duì)比

圖1 GB 8270-1999標(biāo)準(zhǔn)stevioside對(duì)照品、rebaudioside A對(duì)照品和甜菊糖甙樣品高效液相色譜圖

2.2.2 JECFA 2010標(biāo)準(zhǔn)色譜條件色譜柱：Phenomenex C184.6mm×250 mm 5μm；流動(dòng)相：乙腈-10mmol/L磷酸鹽緩沖溶液pH 2.6（32∶68）；流速：1.0 m L/min；檢測波長：210 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL。按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法對(duì)各規(guī)格甜菊糖甙進(jìn)行檢測并記錄色譜圖，見圖2。

圖2 JECFA 2010標(biāo)準(zhǔn)stevioside對(duì)照品、rebaudioside A對(duì)照品和甜菊糖甙樣品高效液相色譜圖

2.2.3 FCC 2009標(biāo)準(zhǔn)色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX NH24.6mm×150 mm 5μm；流動(dòng)相：乙腈-pH 4.3醋酸鹽緩沖溶液（80∶20）；流速：1.5mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：12μL。按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法對(duì)各規(guī)格甜菊糖甙進(jìn)行檢測并記錄色譜圖，見圖3。

圖3 FCC 2009 標(biāo)準(zhǔn)stevioside對(duì)照品、rebaudioside A對(duì)照品和甜菊糖甙樣品高效液相色譜圖

2.3 結(jié)果

按上述3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法分別測定不同規(guī)格甜菊糖甙樣品的含量，結(jié)果見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)方法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

3 討論

3.1 影響甜菊糖甙含量測定結(jié)果的主要因素

通過對(duì)含量測定方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)及對(duì)表5試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，影響甜菊糖甙含量測定結(jié)果的因素主要有以下幾個(gè)方面。

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇FCC 2009標(biāo)準(zhǔn)推薦使用USP的對(duì)照品，JECFA 2010標(biāo)準(zhǔn)推薦使用Wako或ChromaDex公司的對(duì)照品。對(duì)表5數(shù)據(jù)計(jì)算，3個(gè)公司的Rebaudioside A對(duì)照品分別測定樣品1含量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%，3個(gè)公司的Stevioside對(duì)照品分別測定樣品2含量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，均滿足相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得大于2%的限度要求，因此上述對(duì)照品均可作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用。

3.1.2 色譜條件的選擇GB 8270-1999和FCC 2009標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜法采用-NH2柱。JECFA 2010標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜法采用C18柱。通過試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)-NH2柱優(yōu)點(diǎn)是分離度高，缺點(diǎn)是重現(xiàn)性差，色譜柱使用壽命短、成本高。C18柱優(yōu)點(diǎn)是重現(xiàn)性好，色譜柱使用壽命長、成本低，分析時(shí)間短，缺點(diǎn)是分離度不高。

3.1.3 甜菊糖甙各組分含量的定量方法GB 8270-1999標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法一是液相色譜法，以Stevioside為對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線法（峰面積-濃度曲線）計(jì)算甜菊糖甙各組分的含量。JECFA 2010標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法是液相色譜法，以Rebaudioside A為對(duì)照品，外標(biāo)法計(jì)算樣品中Rebaudioside A的含量，以Stevioside為對(duì)照品，外標(biāo)法計(jì)算樣品中其它甜菊糖甙各組分的含量。FCC 2009標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法是液相色譜法，以Rebaudioside A為對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中Rebaudioside A的含量，以Stevioside為對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中其它甜菊糖甙各組分的含量。對(duì)表5樣品1含量結(jié)果數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，以Stevioside為對(duì)照品計(jì)算樣品中Rebaudiosdie A的含量比以Rebaudioside A為對(duì)照品計(jì)算樣品中Rebaudioside A的含量測定結(jié)果偏高。通過試驗(yàn)對(duì)比還發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)是精密度和準(zhǔn)確度高，缺點(diǎn)是操作繁瑣，對(duì)照品用量多、成本高。外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，對(duì)照品用量少、成本低，缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度和精密度不高，但能夠滿足要求。

3.1.4 甜菊糖甙含量的計(jì)算方法：GB8270-1999標(biāo)準(zhǔn)的甜菊糖甙含量以5個(gè)組分（見注1）之和計(jì)算，JECFA 2010和FCC 2009標(biāo)準(zhǔn)的甜菊糖甙含量以9個(gè)組分（見注2）之和計(jì)算，目前已經(jīng)能夠分離和鑒定甜菊糖甙9個(gè)組分[2-4]，所以甜菊糖甙的含量以9個(gè)組分的含量之和計(jì)算較為科學(xué)合理。

綜上所述，GB 8270-1999標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法以液相色譜法作為仲裁法，有值得商榷的內(nèi)容，例如：以Stevioside為對(duì)照品計(jì)算樣品中Rebaudioside A組分的含量，甜菊糖甙含量為5個(gè)組分（見注1）之和。其含量測定方法二容量法存在操作繁瑣，重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，不能滿足當(dāng)前甜菊糖甙產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量控制的需要。所以推薦采用JECFA 2010標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法對(duì)甜菊糖甙產(chǎn)品在提取、精制生產(chǎn)過程中進(jìn)行質(zhì)量控制，其具有操作簡便、色譜系統(tǒng)穩(wěn)定和分析快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，能夠很好地滿足在線生產(chǎn)質(zhì)量控制需求。FCC 2009標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法具有精密度和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，則適合于高純Rebaudioside A（含量不小于95%）的含量測定。

3.2 國內(nèi)和國際甜菊糖甙質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展趨勢

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不斷發(fā)展的目的是要適應(yīng)產(chǎn)品發(fā)展的需要，甜菊糖甙工業(yè)已經(jīng)從第一代產(chǎn)品甜菊糖總甙，第二代產(chǎn)品Stevioside和Rebaudioside A的混合物，發(fā)展到現(xiàn)在的第三代產(chǎn)品高純Rebaudioside A（含量不小于95%）。美國食品和藥物管理局FDA（United States Food and Drug Administration）在2008年12月簽發(fā)了GRAS（Generally Recognized As Safe），確認(rèn)高純Rebaudioside A（含量不小于95%）可用作一般安全性零卡路里食品甜味劑在普通食品和飲料中按生產(chǎn)需要適量使用。從2008年至今，澳大利亞、新西蘭、法國、瑞士等國家也先后頒發(fā)了Rebaudioside A食用品許可。

目前國內(nèi)GB 8270-1999標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)于第一代和第二代甜菊糖甙產(chǎn)品；JECFA 2010標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)于第一代和第二代甜菊糖甙產(chǎn)品，不完全適用于第三代甜菊糖甙產(chǎn)品；FCC 2009適應(yīng)于第三代甜菊糖甙產(chǎn)品。3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)主要在性狀、理化檢測項(xiàng)目和指標(biāo)限量規(guī)定等存在差異（見表4），在表4中可以對(duì)比發(fā)現(xiàn)在理化檢測項(xiàng)目比吸光度、比旋光度、pH、甲醇?xì)埩?、乙醇?xì)埩艉豌U的測定要求上GB 8270-1999標(biāo)準(zhǔn)和JECFA 2010及FCC 2009標(biāo)準(zhǔn)存在較大差距，因此，為了滿足當(dāng)前第三代甜菊糖甙產(chǎn)品的質(zhì)量控制需要，中國國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑甜菊糖甙GB 8270-1999需要進(jìn)一步的更新修訂。相信在對(duì)甜菊糖甙質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不斷深入研究下，國際上能夠達(dá)成較為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，從而促進(jìn)甜菊糖甙工業(yè)的健康發(fā)展。

[1]GB 8270-1999.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑甜菊糖甙[S].

[2]Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives.Steviol Glycosides[S].published in FAO JECFA，2010，Monographs 10.

[3]Food Ingredients Expert Committee.Rebaudioside A[S].Published in Food Chem icals Codex,2009 6：1438.

[4]Jaroslav Pól，Barbora Hohnovác，Tuulia Hyotylainen.Characterisation of Stevia Rebaudiana by comprehensive two-dimensional

liquid chromatography time-of-flightmass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2007，1150（1-2）：85-92.

[5]BrantC.Hoekstra，Keith A.Chamberlain，James S.Traub，et al.Comparative study of HPLCMethods for the Analysis of Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana[R].57th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research，2009.

[6]楊揚(yáng)，陳社云，陳凱，等.甜菊糖提取工藝進(jìn)展及發(fā)展前景[J].中國食品添加劑，2010（5）：194-199.

[7]楊心偉.芻議國家標(biāo)準(zhǔn)GB 8270-1999的修訂[J/OL].廣州化工，2010（3）：46-48.

Study on Quality Standard of Natural Sweetener Steviol G lycosides

KOU Yan-jie，HUA Jun，QIN Ling
(ChengduWagott Pharmaceutical Co.,Ltd.,Chengdu 610041，China)

The comparative experiment of national and international analytical methods of natural sweetener steviol glycosides was conducted,and suitable specification of quality standard for steviol glycosides products by extracting and refining from the dry leaves of Stevia rebaudiana was explored.

steviol glycosides；natural sweetener；quality standard

S556.9

A

1007-2624（2012）02-0069-04

2011-10-12

寇彥杰，男，工程師，研究方向?yàn)樘烊恢参锾崛∥铩?/p>