朱蕙君 王仁生

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，局部區(qū)域復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是鼻咽癌治療失敗的兩大主因。5年累積復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率分別為18%～30%和15%～25%［1］。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)在肺癌、乳腺癌、腸癌及頭頸部腫瘤中的過(guò)度表達(dá)及突變而引起下游的MARK和PI3K通路的持續(xù)活化是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡抑制并促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制［2］。近年研究證實(shí)，80%～90%的鼻咽癌組織中存在EGFR過(guò)度表達(dá)，其過(guò)度表達(dá)在臨床上與預(yù)后差、轉(zhuǎn)移快、對(duì)化療藥物抗拒相關(guān)［3］。近年來(lái)，以EGFR為靶點(diǎn)的低分子抑制劑吉非替尼(gefitinib)的分子靶向治療方法，已證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌等腫瘤治療中應(yīng)用并取得良好的療效，但在鼻咽癌中的研究尚處起步［4］。本文通過(guò)觀察吉非替尼結(jié)合放射照射對(duì)CNE1和HONE1細(xì)胞的干預(yù)作用，旨在探討EGFR的表達(dá)對(duì)鼻咽癌的聯(lián)合治療效果的影響及其作用機(jī)制。

材料與方法

1.細(xì)胞系:人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1及HONEl為廣西醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉科實(shí)驗(yàn)室保存，用含10%FBS、100U/m l青霉素和100mmol/L鏈霉素的RPMIl640培養(yǎng)液培養(yǎng)液在常規(guī)37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.試劑:吉非替尼溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，一次抗體EGFR兔多克隆抗體(Santa cruz公司)，免疫熒光二次抗體羊抗兔IgG(Invitrogen公司);細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑(Cell Counting Kit－8)CCK－8，結(jié)晶紫(crystal violet)。

3.方法:(1)免疫熒光測(cè)定EGFR表達(dá):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的CNE1細(xì)胞和HONE1細(xì)胞接種于3.5mm盤內(nèi)，24h后光學(xué)顯微鏡下確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。采用4%多聚甲醛固定15min后，PBS漂洗3次后，Triton－100進(jìn)行通透，5%BSA封閉后，分別加入一抗及二抗孵育1h后，PBS漂洗3次后，熒光顯微鏡下觀察。采用Image J系統(tǒng)處理圖像。(2)細(xì)胞分組及藥物處理:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鼻咽癌CNE1和HONEl細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組(對(duì)照組，吉非替尼組，單純照射組及藥物照射組)，吉非替尼組的藥物濃度為0、0.1、1、5、10μmol/L。單純照射組的放射劑量為 0、2、4、6、8Gy。藥物照射組，在 30min前先投入0.1μmol/L的吉非替尼。(3)細(xì)胞活性測(cè)定:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的CNE1細(xì)胞和HONE1細(xì)胞接種于96孔，每孔接種2×103個(gè)細(xì)胞，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，分別按分組給予不同濃度的吉非替尼及劑量的放射線照射。治療后持續(xù)培養(yǎng)5～7天。加入10μl CCK－8孵育2h后，在分光光度計(jì)下測(cè)量其分光光度值。根據(jù)公式:細(xì)胞存活率(%)=［(陽(yáng)性組吸光度－空白組吸光度)/(陰性組吸光度 －空白組吸光度)］×100%，計(jì)算出細(xì)胞存活率。(4)克隆形成實(shí)驗(yàn):以1000個(gè)細(xì)胞的密度接種在6mm內(nèi)，分單純照射組和藥物照射組，24h后進(jìn)行照射。在37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，吸靜培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，10%甲醛固定20min，0.5%的結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下觀測(cè)并計(jì)數(shù)細(xì)胞的克隆數(shù)(含有≥50個(gè)細(xì)胞的集落)。根據(jù)公式:貼壁率(plating efficiency，PE)=對(duì)照組集落數(shù)(0Gy集落數(shù))/細(xì)胞接種數(shù)×100%;存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction，SF)=某劑量照射后形成的集落數(shù)/(該劑量下接種細(xì)胞數(shù)×PE)。(5)多靶單擊模型計(jì)算放射增敏比:按多靶單擊數(shù)學(xué)模型S=1－(1－e－D/D0)N擬合細(xì)胞存活曲線。S指存活分?jǐn)?shù)，D為照射劑量，D0是在劑量效應(yīng)曲線的直線部分S每下降63% 所需的劑量，N代表直線部分外延至Y軸的截距(稱外推值)，e為自然對(duì)數(shù)的底。Do反映細(xì)胞在相對(duì)高劑量區(qū)對(duì)射線的敏感性，Do值愈大，細(xì)胞對(duì)放射愈抗拒。Dq值代表存活曲線的“肩寬”，表示從開始到細(xì)胞呈指數(shù)性死亡所浪費(fèi)的劑量，Dq值小，表明細(xì)胞亞致死性損傷修復(fù)能力弱，很小的劑量就能使細(xì)胞進(jìn)入致死性損傷的指數(shù)性死亡階段。增敏比(SER):聯(lián)合治療組Do/放射組Do。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)，采用t檢驗(yàn)比較各組差別，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.免疫熒光對(duì)EGFR表達(dá)的測(cè)定:在熒光顯微鏡放大40倍下觀測(cè)可見(jiàn)，CNE1細(xì)胞和HONE1細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)較強(qiáng)的綠色熒光。顯示EGFR在兩種細(xì)胞內(nèi)均有較強(qiáng)表達(dá)(圖1)。

圖1 免疫熒光檢測(cè)EGFR的表達(dá)(×40)

2.吉非替尼對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制:單純使用吉非替尼抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的體外實(shí)驗(yàn)表明，隨著吉非替尼濃度的增長(zhǎng)，細(xì)胞存活下降。但只有在較高濃度下，吉非替尼才明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)。而在較低濃度時(shí)，雖可抑制其生長(zhǎng)但作用不明顯(圖2)。

圖2 吉非替尼對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

3.單純照射和藥物照射對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制: CNE1細(xì)胞株和HONE1細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)中均可見(jiàn)單純照射組中，隨著照射量的增長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制。而藥物照射組表明，聯(lián)合使用吉非替尼可更進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。在低照射劑量下與單純照射組相比細(xì)胞生存率有顯著差異(表1、圖3、圖4)。

表1 單純照射組和藥物照射組細(xì)胞的存活率

圖3 單純照射及藥物照射對(duì)CNE1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

圖4 單純照射及藥物照射對(duì)HONE1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

3.存活曲線的繪制及SER值的計(jì)算:使用Sigmaplot軟件繪制存活曲線見(jiàn)圖5，擬合方程得出: CNE1細(xì)胞株單純照射組細(xì)胞存活曲線的 Do為2.069Gy，Dq為3.99Gy，藥物照射組Do為1.67Gy， Dq為2.49Gy，放射增敏比(SER)為1.23。HONE1細(xì)胞株照射組Do為2.0Gy，Dq為3.59Gy，藥物照射組Do為1.490Gy，Dq為2.71Gy，SER為1.35。

圖5 單純照射組和藥物照射組的細(xì)胞存活曲線

討論

80%～96%的頭頸部腫瘤中存在EGFR的過(guò)度表達(dá)及突變，EGFR作為頭頸部腫瘤的診斷和預(yù)后的標(biāo)志物成為研究的重要靶點(diǎn)。Ma等［5］的研究表明，在鼻咽癌組織中，EGFR陽(yáng)性表達(dá)率為94%，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為50%。EGFR表達(dá)與鼻咽癌的原發(fā)灶分期相關(guān)，EGFR強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)患者總生存率和無(wú)瘤生存率均較差。針對(duì)EGFR的分子靶向治療方法備受關(guān)注，吉非替尼可抑制EGFR受體的酪氨酸激酶的自身磷酸化，抑制下游分子水平和通路活化。從而控制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。在肺癌，乳腺癌，腸癌中已取得一定療效，而對(duì)鼻咽癌的治療效果報(bào)道結(jié)論不一［6，7］。臨床治療及研究旨在應(yīng)用分子靶向治療結(jié)合放化療等聯(lián)合治療方法，旨在提高鼻咽癌患者生存率。

本研究顯示，CEN1細(xì)胞和HONE1細(xì)胞中均有較高EGFR表達(dá)。單純使用吉非替尼抑制細(xì)胞生長(zhǎng)表明，鼻咽癌細(xì)胞CNE1和HONE1細(xì)胞吉非替尼較不敏感細(xì)胞。此結(jié)果與Brigette等人的研究結(jié)果相近。由于EGFR及其下游通路與旁通路信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相互影響，單一的靶向治療尚難達(dá)到理想的抑制效果［7］。而藥物照射組較單純照射組表明，聯(lián)合吉非替尼能均可提高兩種細(xì)胞株鼻咽癌細(xì)胞的抑制率。吉非替尼可能通過(guò)提高放射敏感性，與放射線照射對(duì)腫瘤細(xì)胞起協(xié)同抑制作用。擬合曲線表明吉非替尼使細(xì)胞存活曲線的Do值降低，直接增加細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性;并且使細(xì)胞存活曲線的肩區(qū)變窄，Dq值變小，抑制細(xì)胞對(duì)放射線所致的潛在致死損傷的修復(fù)(potential damage repair，PLDR)和亞致死損傷的修復(fù)(sublethal damage repair，SLDR)。

研究表明，放射線照射聯(lián)合EGFR抑制劑在體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證明可對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用，提高腫瘤的局部控制［8］。多數(shù)研究證明吉非替尼競(jìng)爭(zhēng)性抑制EGFR下游MARK和PI3K通道，而誘發(fā)G0/G1期阻滯的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。最近研究表明，除了G1期阻滯外，聯(lián)合治療還可以延長(zhǎng)G2期，減少放射抵抗的S期從而增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性［9，10］。

PLDR是造成放射治療失敗的主要原因，PLDR與DNA雙鏈斷裂修復(fù)(DNA double strand break repair，DSB repair)相關(guān)［11］。放射線照射后初期野生型EGFR(wild type EGFR)由細(xì)胞膜向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移進(jìn)而偶聯(lián)生成DNA修復(fù)酶(DNA－repair enzyme)是照成放射抵抗的重要機(jī)制［12］。DNA－PKcs蛋白在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中起著重要作用，是一種與放射敏感性密切相關(guān)的修復(fù)蛋白。EGFR通過(guò)下游PI3K－AKT通道刺激DNA－PKcs活化，高EGFR的表達(dá)和活化也伴隨著DNA－PKcs的增加。而這一過(guò)程可有效地被EGFR抑制劑所抑制。另外，EGFR還被證實(shí)影響另外一種DSB修復(fù)的關(guān)鍵蛋白Ku70/ Ku80。實(shí)體瘤內(nèi)細(xì)胞存在對(duì)射線和化療藥物有抗性的乏氧狀態(tài)是腫瘤復(fù)發(fā)、治療失敗的主要原因。PET動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察表明，EGFR抑制劑還可以改善細(xì)胞的含氧量而增強(qiáng)放射敏感性。

綜上所述，本研究結(jié)果初步顯示吉非替尼聯(lián)合放射照射對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，并研討其放射增敏機(jī)制。為分子靶向治療聯(lián)合放療的綜合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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