喬峰，張健美，白銀磊，楊信怡，李聰然，李國慶，胡辛欣，游雪甫

·論著·

結(jié)核分枝桿菌鐵氧還蛋白還原酶FdrA 和FprA在CYP125A1的電子傳遞鏈中的作用分析

喬峰，張健美，白銀磊，楊信怡，李聰然，李國慶，胡辛欣，游雪甫

目的體外評價結(jié)核分枝桿菌（Mtb）鐵氧還蛋白還原酶FdrA 和 FprA 的活性，探索它們分別與兩種鐵氧還蛋白的偶聯(lián)作用，并分析它們在 CYP125A1 的電子傳遞鏈中的作用。

分枝桿菌，結(jié)核； 鐵氧還蛋白 NAPP 還原酶； 細(xì)胞色素 P450 酶系統(tǒng)； 電子傳遞鏈復(fù)合蛋白質(zhì)類

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(3):178-186

1998 年結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）H37Rv 基因組測序工作的完成標(biāo)志著對 Mtb 的研究進(jìn)入了一個嶄新的時代[1]。目前發(fā)現(xiàn) Mtb 有 20 種細(xì)胞色素P450 酶（以下簡稱 P450 酶）編碼基因[1]，已有研究表明這些P450 酶均具有非常重要的生理生化功能，如CYP128A1 可能與 Mtb 最適生長相關(guān)[2]，CYP121A1參與一種二級代謝產(chǎn)物的合成[3]等。近年來研究發(fā)現(xiàn) CYP125A1 編碼基因所在的操縱子在感染巨噬細(xì)胞時被誘導(dǎo)表達(dá)且是必需的[4]，并且 CYP125A1（可能還有 CYP142A1）是 Mtb 在體外利用膽固醇作為碳源正常生長的關(guān)鍵酶，參與 Mtb 感染宿主后的能量代謝和碳源供應(yīng)，可以作為基于膽固醇降解的潛在藥物作用靶點[5-8]。細(xì)菌的 P450 酶需要與一個鐵氧還蛋白還原酶（ferredoxin reductase，F(xiàn)DR）和一個鐵氧還蛋白（ferredoxin，F(xiàn)DX）共同組成一個催化系統(tǒng)才能完成催化反應(yīng)，其中 FDR 和 FDX 共同組成 P450 酶的電子傳遞鏈，如惡臭假單胞菌中 P450 cam 在假單胞氧還蛋白還原酶和假單胞氧還蛋白電子傳遞鏈的作用下，催化樟腦5 位環(huán)氧化[9]。Mtb 基因組有 5 個 FDX、2 個FDR 和 2 個 FDRX（由一個 FDX 結(jié)構(gòu)域和一個FDR 結(jié)構(gòu)域組成的融合蛋白）編碼基因[1]，從而可以推測這 20 個 P450 酶的電子傳遞鏈由FDR/FDX 或者 FDRX 中的一種或數(shù)種組成。所以為了更加明確 CYP125A1 及其他 P450 酶的生理功能，對其電子傳遞鏈的研究就非常重要。

目前研究發(fā)現(xiàn) FdrA（Rv0688）是 NADH 依賴的鐵氧還蛋白還原酶，并且可以與 Mtb Fdx （Rv0763c，簡稱 Fdx）偶聯(lián)，從而支持 CYP51B1的活性[10]；FprA（Rv3106）是 NADPH 依賴的鐵氧還蛋白還原酶，也可以與 Fdx 偶聯(lián)從而支持CYP51B1 的活性[11-13]。本研究外源表達(dá)了 FdrA、FprA 和 CYP125A1；通過體外研究分析了 FdrA 和 FprA 在 CYP125A1（Rv3545c）電子傳遞鏈中的作用，推測出 FprA 為 CYP125A1 催化系統(tǒng)的成員，進(jìn)一步明確了 CYP125A1 的生理功能，并為建立以 CYP125A1 催化系統(tǒng)作為藥物靶點的體外藥物篩選體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒 克隆菌株 E.coli DH5α，表達(dá)菌株 E.coli BL21 DE3，質(zhì)粒 pET-30a(+) 均由本實驗室保藏。

1.1.2工具酶、試劑盒和生化試劑 限制性內(nèi)切酶 Nde I、Xho I，T-A 克隆試劑盒，DNA 連接試劑盒，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（低）購自日本 TaKaRa 公司；Taq DNA 聚合酶購自美國 Promega 公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；4-膽甾烯-3-酮、5-氨基酮戊酸、菠菜鐵氧還蛋白（spFDX）和菠菜鐵氧還蛋白還原酶（spFDR）購自美國Sigma 公司；其余試劑均購自生工生物工程（上海）有限公司；引物合成及測序工作由美國Invitrogen 公司完成；蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜檢測由國家生物醫(yī)學(xué)分析中心完成。

1.1.3主要儀器 AKTA purifier 蛋白純化儀購自美國通用電氣公司；Enspire 2300 酶標(biāo)儀購自美國Perkin Elmer 公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀（配有 DAD 檢測器）購自美國安捷倫科技公司。

1.2 方法

1.2.1FdrA、FprA 和 CYP125A1 編碼基因的克隆 FdrA 上游引物：5′ CCATATGAACGCACACG TGACCAGTCGTGAA 3′，下游引物：5′ TGTCTCGA GGGCCTGAGTTTGGTCTAACACT 3′；FprA 上游引物：5′ CACATATGCGTCCCTATTACATCGCCAT CG 3′，下游引物：5′ ACTCGAG GCCGAGCCCAAT CCGCAACAG 3′；CYP125A1 上游引物：5′ GACAT ATGTCGTGGAATCACCAGTCA 3′，下游引物：5′ A ATCTCGAGGTGAGCAACCGGGCATCT 3′。上游引物分別加入 Nde I 酶切位點，用下劃線表示；下游引物分別加入 Xho I 酶切位點，用下劃線表示，以 Mtb H37Rv 基因組為模板擴(kuò)增目的基因。這三個基因的 PCR 反應(yīng)條件均為：95 ℃ 4 min；95 ℃1 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，循環(huán) 30 次；72 ℃10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用 Nde I、Xho I 雙酶切，連接至經(jīng) Nde I、Xho I 雙酶切的 pET-30a(+) 載體中，轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21 DE3 感受態(tài)細(xì)胞，并經(jīng) PCR鑒定和測序鑒定成功。其中重組質(zhì)粒在 C 端含6 × His 標(biāo)簽，以便蛋白親和層析。

1.2.2FdrA、FprA 和 CYP125A1 的蛋白表達(dá)、純化及定量 FdrA 和 FprA 重組菌株接種于含50 μg/ml 卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)至 OD600為 0.6，加入 IPTG 至終濃度0.5 mmol/L，再于 20 ℃，100 r/min 繼續(xù)培養(yǎng) 30 h。CYP125A1 重組菌株待培養(yǎng)至 OD 值為 0.6 時加入 IPTG 至終濃度 1 mmol/L，5-氨基酮戊酸至終濃度為 1 mmol/L，然后于 28 ℃，150 r/min 繼續(xù)培養(yǎng) 30 h。收集菌體，重懸于 1/10 體積的裂解緩沖液[20 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.5 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），pH 8.0]中，冰上超聲破碎細(xì)胞，4 ℃，16 000 × g 離心 30 min，上清用 0.22 μm 濾器過濾后于 AKTA Purifier 蛋白純化儀中進(jìn)行純化。鎳柱預(yù)先用結(jié)合緩沖液（20 mmol/L 磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.4）平衡，采用咪唑 20 ～500 mmol/L 線性梯度進(jìn)行洗脫并收集洗脫組分。然后將含有目的蛋白的組份加入至預(yù)先用 50 mmol/L HEPES 緩沖液（10％ 甘油，V∶V，pH 7.4）平衡的 PD-10 脫鹽柱中，并用相同緩沖液洗脫蛋白。所有蛋白均采用 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（增強(qiáng)型）進(jìn)行定量。純化蛋白分裝保存于 –70 ℃ 冰箱，每次使用時冰上解凍即可恢復(fù)全部活性。

1.2.3采用 2,6-二氯酚靛酚為電子受體評價 FdrA 和 FprA 的活性 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）是一種氧化還原染料，氧化態(tài)呈藍(lán)色，還原態(tài)無色，可以直接接受 FDR 傳遞的電子，從而可以用來評價FDR 對 NAD(P)H 的氧化活性。反應(yīng)在 50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）中進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行監(jiān)測，200 μl 反應(yīng)體系中含有 200 nmol/L FDR，100 μmol/L DCPIP 和一系列濃度的 NAD(P)H，通過監(jiān)測 DCPIP 在 30 ℃，600 nm 下吸光度的降低來計算反應(yīng)速率，將底物濃度與反應(yīng)速率用SigmaPlot 13.0 軟件擬合酶動力學(xué)參數(shù)。并采用該方法考察 NAD+和 NADP+分別對 FdrA 和 FprA活性的影響。

1.2.4采用細(xì)胞色素 C 為電子受體研究 FdrA 或 FprA 分別與 Fdx 或 spFDX 的偶聯(lián)情況 細(xì)胞色素 C 是一類鐵血紅素蛋白，生理條件下介導(dǎo)電子從復(fù)合體 III 轉(zhuǎn)移至復(fù)合體 IV，體外條件下可以接受 FDX 傳遞的電子，從而可以用來評價FDR 與 FDX 的偶聯(lián)作用。反應(yīng)在 50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）中進(jìn)行，200 μl 反應(yīng)體系中含有 200 nmol/L FDR，1 μmol/L FDX，500 μmol/L細(xì)胞色素 C 和一系列濃度的 NAD(P)H，通過監(jiān)測細(xì)胞色素 C 在 30 ℃，550 nm 下吸光度的升高來計算反應(yīng)速率，將底物濃度與反應(yīng)速率進(jìn)行酶動力學(xué)參數(shù)擬合。并采用相同方法考察 NAD+和NADP+分別對 FdrA 和 FprA 活性的影響。

1.2.5HPLC 分析 FdrA 和 FprA 對 CYP125A1代謝 4-膽甾烯-3-酮活性的電子傳遞作用 4-膽甾烯-3-酮溶于 50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.5，含 10％ 羥丙基-β-環(huán)糊精），配成 1 mmol/L 的儲存液。CYP125A1 催化 4-膽甾烯-3-酮羥基化的反應(yīng)在50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）中進(jìn)行，200 μl反應(yīng)體系中含有 100 nmol/L CYP125A1，1 μmol/L FDX，200 nmol/L FDR，100 μmol/L 4-膽甾烯-3-酮，通過加入 NAD(P)H 再生系統(tǒng)[1 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸，1 Unit 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和 0.5 mmol/L NAD(P)+]啟動反應(yīng)。分別考察 FdrA/Fdx、FdrA/ spFDX、FprA/Fdx 和 FprA/spFDX 對 CYP125A1的電子傳遞作用?？瞻讓φ詹患?P450 酶；陽性對照采用 spFDR/spFDX 電子傳遞鏈，經(jīng) NADPH再生系統(tǒng)啟動反應(yīng)[14]。室溫反應(yīng) 20 h 后，用相同體積乙腈終止反應(yīng)并進(jìn)行蛋白沉淀，13 000 r/min 室溫離心 20 min，取 20 μl 上清進(jìn)行高效液相分析。色譜條件如下：色譜柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-異丙醇（85∶15，V∶V）；流速：1 ml/min；檢測波長：240 nm；柱溫：室溫。

2 結(jié)果

2.1 純化的 FdrA、FprA 與 CYP125A1 的 SDSPAGE鑒定及肽指紋圖譜鑒定

純化的 FdrA、FprA 和 CYP125A1 的 SDSPAGE 鑒定結(jié)果分別如圖 1A，1B 和 1C 所示，F(xiàn)drA、FprA 與 CYP125A1 大小均與預(yù)測分子量一致，并且呈現(xiàn)單一條帶，是較純的蛋白。將對應(yīng)條帶切出并用胰蛋白酶處理，采用 MALDI-TOF-MS進(jìn)行肽指紋圖譜檢測（圖 2），肽指紋圖譜結(jié)果用MASCOT 在線軟件進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn) FdrA 得分為 127，F(xiàn)prA 為 185，CYP125A1 為 221（得分大于 85 分即P＜ 0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義），因此純化的 FdrA、FprA 和 CYP125A1 是正確的。

圖1 SDS-PAGE 檢測 FdrA（A），F(xiàn)prA（B）和 CYP125A1 （C）Figure 1 SDS-PAGE analysis of FdrA (A), FprA (B) and CYP125A1 (C)

2.2 FdrA、FprA 與 CYP125A1 的光譜學(xué)鑒定

圖2 FdrA（A）、FprA（B）和 CYP125A1（C）的肽指紋圖譜Figure 2 The peptide mass fingerprint of FdrA (A), FprA (B) and CYP125A1 (C)

FdrA、FprA 與 CYP125A1 均溶解在 50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）中，300 ～ 700 nm 對各個蛋白進(jìn)行光譜掃描，掃描結(jié)果見圖 3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FdrA（圖 3A）和 FprA（圖 3B）均在 370 nm 和445 nm 下有特殊的吸收峰，與文獻(xiàn)[10，13]報道一致。CYP125A1（圖 3C）在 393、415 和 530 nm呈現(xiàn)特殊的吸收峰，與文獻(xiàn)[8]報道一致。

圖3 FdrA（A）、FprA（B）和 CYP125A1（C）的光譜掃描圖Figure 3 UV/visible spectrum of pure FdrA (A), FprA (B) and CYP125A1 (C)

2.3 采用 DCPIP 為電子受體評價 FdrA 和 FprA的活性

以 DCPIP 作為電子受體，F(xiàn)drA 對 NADH 的Km 值在 22 ～ 27 μmol/L 之間，Kcat 值在 375 min-1左右；在所設(shè)定濃度范圍（0 ～ 200 mmol/L）內(nèi)，檢測不出 FdrA 對 NDAPH 的降解作用，因此FdrA 對 NADH 的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對 NADPH 的親和力（表 1）。FprA 對 NADH 的Km 值在 55 ～72 μmol/L 之間，Kcat 值在 118 min-1左右（表 1）；在 NADPH 的各個濃度下，F(xiàn)prA 最初可以快速降解 NADPH，但是反應(yīng)速率均隨著時間迅速減慢，導(dǎo)致反應(yīng)速率無法確證，酶動力學(xué)參數(shù)無法擬合。這種現(xiàn)象暗示了 NADPH 的代謝物 NADP+為FprA 的潛在抑制劑，隨著 NADP+的不斷生成，反應(yīng)抑制程度逐漸加深。因此本研究考察了以 NADH作為電子供體，不同濃度（0、10 和 100 μmol/L）的 NAD+和 NADP+分別對 FdrA 和 FprA 活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAD+對 FdrA 和 FprA 均無抑制作用，NADP+對 FdrA 也無抑制作用（表 1）；但是 NADP+對 FprA 有明顯的抑制作用，F(xiàn)prA對抑制劑 NADP+的 Ki =（2.42 ± 0.42）μmol/L，并且雙倒數(shù)曲線交于縱軸，符合競爭性抑制劑的特征（圖 4）。

表1 以 DCPIP 作為電子受體，F(xiàn)drA 和 FprA 對 NADH 或 NADPH 的酶動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of FdrA and FprA to NAD(P)H in the presence of DCPIP

2.4 以細(xì)胞色素 C 為電子受體研究 FdrA 或FprA 分別與 Fdx、spFDX 的偶聯(lián)情況

Fdx 的基因克隆，蛋白外源表達(dá)純化采用Bellamine 等[11]報道的方法。FdrA 利用 NADH 還原細(xì)胞色素 C 在無 FDX 存在時對 NADH 的Kcat 值約 2.4 min-1，Km 值約2.76 μmol/L；在5 倍濃度 Fdx 存在下，F(xiàn)drA 對 NADH 的Km值基本不變，Kcat 值明顯增加至 15.5 min-1；在5 倍濃度 spFDX 存在下，F(xiàn)drA 對 NADH 的Kcat 值和Km 值均基本不變（表 2）。無 FDX 存在時，F(xiàn)prA 對 NADPH 的 Kcat 值約3.0 min-1，Km 值約 10.65 μmol/L；在 5 倍 Fdx 存在下，F(xiàn)prA 對 NADPH 的Km 值增加為 14.02 μmol/L，但是 Kcat 值明顯增加至 26.5 min-1；在 5 倍spFDX 存在下，F(xiàn)prA 對 NADPH 的Km 值增加為 12.57 μmol/L，Kcat 值明顯增加至 16.4 min-1（表 2）。無 FDX 存在時，F(xiàn)prA 對 NADH 的Km值約 60 μmol/L，Kcat 值約 1.8 min-1；在 5 倍 Fdx存在下，F(xiàn)prA 對 NADH 的Km 值基本不變，Kcat值增加至 2.4 min-1；在 5 倍 spFDX 存在下，F(xiàn)prA 對 NADH 的Km 值基本不變，Kcat 值增加至2.0 min-1（表 2）。FprA 對 NADPH 的Km 值明顯小于對 NADH 的Km 值，并且 Kcat 值也明顯大于對 NADH 的Kcat 值，因此 FprA 對 NADPH的親和力明顯高于 NADH（表 2）。在此條件下沒有發(fā)現(xiàn) NAD+和 NADP+對 FdrA 或 FprA 有任何抑制作用（表 2）。

圖4 不同濃度 NADP+對 FprA 酶動力學(xué)曲線的影響（A：米氏曲線；B：Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖）Figure 4 The kinetic curves of FprA in various concentrations of NADP+(A: Michaelis-Menten curve; B: Lineweaver-Burk curve)

表2 細(xì)胞色素 C 為電子受體時，F(xiàn)drA 和 FprA 對 NAD(P)H 的酶動力學(xué)參數(shù)Table 2 The kinetic parameters of FdrA and FprA to NAD(P)H in the presence of cytochrome C

2.5 HPLC 分析 FdrA 和 FprA 對 CYP125A1 代謝 4-膽甾烯-3-酮活性的電子傳遞作用

CYP125A1 可以在 spFDX 和 spFDR 的輔助下，利用 NADPH 催化膽固醇或 4-膽甾烯-3-酮的 C27 位羥基化[14]，本研究采用此體系作為陽性對照。FdrA 實驗組采用 NADH 再生系統(tǒng)啟動反應(yīng)[10]，F(xiàn)prA 實驗組采用 NADPH 再生系統(tǒng)[13]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4-膽甾烯-3-酮在 13.15 min 左右出峰（圖 5D 和 6D），陽性對照在保留時間 4.3 min左右有一新峰，即代謝物 27-羥基-4-膽甾烯-3-酮的吸收峰（圖 5A和 6A）。FprA/spFDX 實驗組在保留時間 4.3 min 左右也有一個峰（圖 6C），峰面積與陽性對照基本一致，因此在 FprA 和 spFDX輔助下，CYP125A1 也具有對 4-膽甾烯-3-酮相同的催化作用。但是其他實驗組 FdrA/Fdx（圖 5B），F(xiàn)drA/spFDX（圖 5C）和 FprA/Fdx（圖 6B）在4.3 min 均未檢測出吸收峰。

圖 5 高效液相色譜法分析 FdrA 對 CYP125A1 電子傳遞作用（A：陽性對照 spFDR/spFDX；B：實驗組 FdrA/Fdx；C：實驗組 FdrA/spFDX；D：陰性對照）Figure 5 HPLC/UV analyzes the role of FdrA in CYP125A1’s electron transport chain (A: Positive control spFDR/spFDX; B: FdrA/Fdx; C: FdrA/spFDX; D: Negative control)

圖 6 高效液相色譜法分析 FprA 對 CYP125A1 電子傳遞作用（A：陽性對照 spFDR/spFDX；B：實驗組 FprA/Fdx；C：實驗組 FprA/spFDX；D：陰性對照）Figure 6 HPLC/UV analyzes the role of FprA in CYP125A1’s electron transport chain (A: Positive control spFDR/spFDX; B: FprA/Fdx; C: FprA/spFDX; D: Negative control)

3 討論

本研究表明，在體外環(huán)境下 FdrA 更傾向于利用 NADH，NAD+和 NADP+對其活性沒有抑制作用；FprA 則傾向于利用 NADPH。采用細(xì)胞色素 C 作為電子受體時，F(xiàn)drA 對 NADH 的Km值明顯低于以 DCPIP 為電子受體時的Km 值，說明 FdrA 與細(xì)胞色素 C 偶聯(lián)時，可以使得 FdrA 對 NADH 具有更高的親和力。FprA 對 NADH 的Km 值與以 DCPIP 為電子受體時Km 值相當(dāng)，說明 FprA 與細(xì)胞色素 C 偶聯(lián)不會改變其對NADH 的親和力；但是 FprA 降解 DCPIP 時受到NADP+的抑制，降解細(xì)胞色素 C 時卻不會受到NADP+的抑制作用，因此推測與細(xì)胞色素 C 的偶聯(lián)使得 FprA 對 NADP+的親和力明顯下降，從而使得反應(yīng)的方向更容易朝著 NADPH 到 NADP+的方向進(jìn)行。

采用細(xì)胞色素 C 作為電子受體時，F(xiàn)DX 的存在不會影響 FdrA 對 NADH 的 Km 值；在 Fdx介導(dǎo)下，F(xiàn)drA 對 NADH 的Kcat 值明顯大于沒有FDX 時的 Kcat 值，說明 Fdx 存在時 FdrA 的催化效率明顯升高，F(xiàn)dx 可以與 FdrA 進(jìn)行偶聯(lián)；在spFDX 介導(dǎo)下，F(xiàn)drA 對 NADH 的 Kcat 值與沒有FDX 時相當(dāng)，說明 FdrA 與 spFDX 不存在偶聯(lián)。在 Fdx 或 spFDX 介導(dǎo)下，F(xiàn)prA 對 NAD(P)H 的Kcat 值明顯大于沒有 FDX 時的 Kcat 值，說明Fdx 或 spFDX 存在時 FprA 的催化效率明顯升高，F(xiàn)dx、spFDX 與 FprA 均可以進(jìn)行偶聯(lián)，但是spFDX 對 FprA 催化效率的提升沒有 Fdx 明顯。

FdrA 與 FprA 對 CYP125A1 的電子傳遞作用研究發(fā)現(xiàn)，僅 FprA/spFDX 可以支持 CYP125A1的活性，F(xiàn)drA/Fdx、FdrA/spFDX 和 FprA/Fdx 均不能支持 CYP125A1 的活性。因此推測 FprA 可能是 CYP125A1 的電子傳遞鏈蛋白；FdrA 和 Fdx不是 CYP125A1 的電子傳遞鏈蛋白。

總之，我們系統(tǒng)評價了結(jié)核分枝桿菌鐵氧還蛋白還原酶 FdrA 和 FprA 的活性，并首次發(fā)現(xiàn)FprA 可以作為 CYP125A1 的電子傳遞鏈蛋白，從而進(jìn)一步明確了 CYP125A1 在體內(nèi)的生理功能，并為建立以 CYP125A1 催化系統(tǒng)作為藥物靶點的體外藥物篩選體系提供依據(jù)。

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Analysis of the role of FdrA and FprA in CYP125A1’s electron transfer chain, two ferredoxin reductases in mycobacterium tuberculosis

QIAO Feng, ZHANG Jian-mei, BAI Yin-lei, YANG Xin-yi, LI Cong-ran, LI Guo-qing, HU Xin-xin , YOU Xue-fu

ObjectiveTo systematically evaluate the activities of two FDRs (FdrA and FprA), study the interactions between these two FDRs and two ferredoxins, respectively, and analyze the endogenous redox partners of CYP125A1 in vitro.MethodsThe cloned genes were ligated to pET-30a(+) vector and transformed into E.coli BL21 DE3 cells separately. Recombinant proteins were generated by IPTG inducing, followed by affinity purification in Ni column. The activities of FdrA and FprA were evaluated in multilabel reader in the presence of NAD(P)H as the electron donor and DCPIP as the acceptor; the coupling activitiesof FDR and FDX were analyzed in the presence of cytochrome C as the electron acceptor; the activity of CYP125A1 which was supported by FdrA or FprA was evaluated by HPLC.ResultsFdrA preferentially binded NADH and Fdx could increase its activity significantly while spinach ferredoxin (spFDX) didn’t change its activity. The activity of CYP125A1 couldn’t be supported by FdrA/Fdx or FdrA/spFDX. FprA preferentially binded NADPH and Fdx or spFDX increased its activity significantly, besides, Fdx had more potent effect. However, only FprA/spFDX could support the activity of CYP125A1.ConclusionFprA is one of electron transport chain complex proteins of CYP125A1 and FdrA may not be the redox partner of CYP125A1.

Mycobacterium tuberculosis; Ferredoxin reductase; Cytochrome P-450 enzyme system; Electron transport chain complex proteins

YOU Xue-fu, Email: xuefuyou@hotmail.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.004

“十二五”國家科技重大專項（2012ZX09301002-005、2012ZX09301002-001）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所藥理室

游雪甫，Email：xuefuyou@hotmail.com

2012-02-28

方法采用大腸桿菌作為宿主克隆結(jié)核分枝桿菌 FdrA、FprA 和 CYP125A1 編碼基因并進(jìn)行蛋白外源表達(dá)；以NADH 或 NADPH 為電子供體，2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）為電子受體評價 FdrA 及 FprA 的活性；應(yīng)用細(xì)胞色素C 為電子受體研究 FdrA 或 FprA 與不同鐵氧還蛋白的偶聯(lián)作用；分析 CYP125A1 對 4-膽甾烯-3-酮的代謝作用進(jìn)而研究 FdrA 和 FprA 在 CYP125A1 的電子傳遞鏈中的作用。

結(jié)果FdrA 對 NADH 親和力較高，F(xiàn)dx 對 FdrA 活性有明顯提升作用，菠菜鐵氧還蛋白（spFDX）對其活性沒有提升作用，F(xiàn)drA/Fdx 和 FdrA/spFDX 均不能支持 CYP125A1的活性。FprA 對 NAPDH 親和力較高，F(xiàn)dx 和 spFDX 均對 FprA 活性有明顯提升作用，F(xiàn)dx 尤甚，F(xiàn)prA/spFDX 可以支持 CYP125A1 的活性，F(xiàn)prA/Fdx 不能支持 CYP125A1的活性。

結(jié)論FprA 是結(jié)核分枝桿菌 CYP125A1 的電子傳遞鏈蛋白，F(xiàn)drA 可能不是 CYP125A1 的電子傳遞鏈蛋白。

Author Affiliation:Department of Pharmacology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):178-186